（1）细菌的CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR...

（1）细菌的CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

Cas9在基因工程中起到类似于_______（ 填物质）的作用。CRISPR/Cas9 在基因敲除、基因治疗等多方面显示出广阔的应用前景。若要进行基因治疗，首先要获得正常基因，目前比较常用的方法之一是从cDNA文库中获取，但获得的基因与人体内正常基因相比要短，但若要获得的是原核基因则基本相同，原因是___________________。

（2）科学家尝试将某种重组基因导入小鼠体内，以研究该基因的作用机理，常用的导入方法是___________________。目前比较常用的导入对象是小鼠的胚胎干细胞，因为ES细胞在功能上具有________________。经过早期胚胎培养之后获得的胚胎需要经过胚胎移植到_______雌性动物的体内，最终发育成具有新性状的个体。

（3）为了提高胚胎的利用率，科学家选用发育良好的__________进行胚胎分割，在此过程中，需要注意的是______________分割。

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CRISPR/Cas9系统能参与细菌的免疫防御，对抗入侵的外源DNA。CRISPR/Cas9系统主要包括：Cas9核酸内切酶和sgRNA，在sgRNA引导下，Cas9蛋白在目的基因处进行切割，使DNA双链断裂。CRISPR/Cas9系统切割DNA双链的情景如图所示，下列相关叙述正确的是（　　 ）

A.Cas9蛋白切断的是氢键

B.Cas9蛋白具有限制酶的作用

C.图中物质有5种碱基配对类型

D.核糖体能合成CRISPR/Cas9系统

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科学家发现细菌细胞中存在清除入侵病毒DNA的功能系统（见下图1），并发明了CRISPR/Cas9基因编辑技术，目前已成为生物科学领域最热门的基因操作技术。下图2 是科研人员运用CRISPR/Cas9基因编辑技术（其中表达载体1的作用是在受体细胞中控制合成CRISPR复合体，表达载体2可以与相应DNA的同源区进行互换、重组），成功地将基因A精确导入到绒山羊细胞内的甲、乙两个基因之间，并和绿色荧光蛋白基因一起表达的过程示意图。请回答。

（1）由图1可知，CRISPR复合体中crRNA的主要功能是________________________，而Cas9蛋白催化断裂的化学键位于____________之间。细菌的这种清除能力的生理意义是________________________。

（2）结合对图1的理解，图2中表达载体1首先要表达出含有________________________序列的crRNA和Cas9蛋白，以结合形成CRISPR复合体。

（3）根据图2，基因表达载体2上需要加入:①基因甲片段、②基因乙片段、③基因A、④绿色荧光蛋白基因等四种DNA片段，这4种片段在载体上的正确排列顺序应是___________（用序号代表相应片段）。在形成重组DNA时需要___________酶参与催化表达载体2与绒山羊DNA的连接。

（4）实验室一般会将重组DNA导入山羊的胚胎干细胞中，以培育、筛选出转基因山羊，选择胚胎干细胞作为受体细胞的主要依据是______________________。

（5）与传统的基因工程相比较，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是_________________________________。

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CRISPR-Cas9是大肠杆菌等细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的部分病毒（DNA）及外源DNA．其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。CRISPR--Cas9基因编辑技术是通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可以对目标DNA上几乎任何一个位置进行删除或添加特定的DNA片段，如下图所示。下列相关叙述错误的是（　　 ）

A.大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒（DNA）及外源DNA互补的RNA序列

B.识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同

C.Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA分子

D.在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶

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CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统作用机理如图一所示，图一中的CRISPR位点结构如图二所示，过程③作用如图三所示。请据图回答问题：

（1）图一中，新CRISPR序列中a间隔区的来源是______，图二中CRISPR序列上游的前导区中含有______，以保证CRISPR序列转录的正常进行。

（2）图一中，过程①需要______酶的参与，过程②需要的原料有______。

（3）图三中，向导RNA上的识别序列存在于______（填“tracrRNA”或“crRNA”）上。若α链剪切点附近序列为……TCCACAATC……，则向导RNA相应的识别序列为______。由此推测，tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白组装的系统类似于基因工程中的______酶。

（4）原核生物通过CRISPR/Cas系统抵抗外源遗传物质的入侵类似哺乳动物的______（填“初次”或“二次”）免疫。

（5）一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿于2018年11月在中国健康诞生。这对双胞胎的一个CCR5基因经过CRISPR/Cas9敲除，使她们出生后即能天然抵抗艾滋病。这是世界首例免疫艾滋病的基因婴儿，也意味着中国在基因编辑技术用于疾病预防领域实现历史性突破。但这项研究也引起了争议，下列属于该项研究争议的有______（多选）。

A．伦理上的担忧

B．CRISPR/Cas9基因编辑技术存在潜在脱靶效应

C．CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CCR5基因后对其他基因的表达有可能存在影响

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CRISPR/Cas系统是细菌在进化过程中形成的一种防御机制。回答下列问题：

（1）Cas蛋白能截取噬菌体DNA片段，并将其插入到细菌自身的CRISPR基因中，此过程需要断开和连接的化学键是__________。

（2）整合有噬菌体DNA片段的CRISPR基因经_______产生RNA，此RNA与Cas蛋白共同构成CRISPR /Cas复合物，在此RNA的引导下，该复合物能定点切割对应的噬菌体DNA片段。由此分析，细菌中CRISPR/Cas系统的生理意义是________。

（3）通过改造此系统，可以实现对DNA的定点切割。在对不同基因进行定点切割时，应使用________（填“相同”或“不同”）的RNA和Cas蛋白构成CRISPR /Cas系统。

（4）科学家利用改造的CRISPR /Cas系统定点破坏绵羊胎儿成纤维细胞中的肌肉生长抑制基因，并用此细胞作为核供体，结合核移植技术，生产出新品种绵羊。

①在核移植时，应选用________期卵母细胞进行去核操作。

②代孕绵羊对移入子宫内的外来胚胎基本不发生________，这为重组胚胎在受体内的存活提供了可能。

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CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关注的一项新技术。该基因表达系统主要包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：

（1）研究发现，CRISPR/Cas9仅存在于原核生物，故需借助____________技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与_____________酶的功能相似。

（2）首先依据___________的部分序列设计DNA片段A（负责编码相应引导RNA），再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体（如图所示）。位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示_____________酶切位点。

（3）质粒B大小为2.5kb（位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60b），经酶切后的片段A大小为0.5kb（千碱基对），连接形成的表达载体大小为___________kb。

（4）常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的_______上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到____________，从而使其得以维持稳定和表达。

（5）CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因_________________________________________________。

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CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关的一项新技术。该基因表达系统主要包含引RNA和Cas9蛋两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：

（1）研究发现，CRISPR/Cas仅存在于原核生物，故需借助__________技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与__________酶的功能相似。

（2）首先依据__________的部分序列设计DNA片段A（负责编码相应引导RNA），再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因达载体（如图所示），该过程中需要用到的两类工具酶有________________。

（3）质粒B大小为2．5kb（位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60b），经酶切后的片段A大小为0．5kb（千碱基对），连接形成的表达载体大小为__________kb。

（4）常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的__________上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到__________，从而使其得以维持稳定和表达。

（5）CRISRP/Cas基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因____________________。

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CRISPR/Cas9系统是由Cas9蛋白（一种核酸酶）和sgRNA（向导RNA）构成的RNA-蛋白复合体，可利用sgRNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目的基因进行编辑（如图所示）。RuBisCo是参与光合作用的关键酶，研究人员拟利用CRISPR/Cas9技术对大豆细胞RuBisCo基因进行定点编辑，以达到提高CO2利用率的目的，回答下列问题：

（1）利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，Cas9蛋白可催化_______________（化学键名称）水解，剪切特定DNA片段，因此Cas9蛋白的这一功能与_______________酶相似。

（2）用于编辑不同基因的CRISPR/Cas9复合物中sgRNA碱基序列不同，因此首先要确定RuBisCo基因中的待编辑序列，根据_______________原则设计引物，通过_______________技术扩增相应的基因序列，作为编码特定sgRNA的模板。该技术所需的Taq酶特点是_______________，能使整个反应体系中DNA解链、退火、链的延伸都能快速进行。

（3）将扩增获得的DNA片段与_______________基因共同导入到质粒载体，构建CRISPR/Cas9表达载体，将构建成功的表达载体通过_______________方法，导入大豆细胞。若检测到受体细胞中组成RuBisCo酶的氨基酸_______________发生了符合预期的改变，则表明基因编辑成功。

（4）CRISPR/Cas9系统在定点编辑基因时仍存在一个最大的弊端，就是有很大概率会造成其他一些非目的基因序列的错误剪接和编辑，请尝试分析其原因_______________。

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CRISPR-Cas9技术又称为基因编辑技术，该技术在基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA（gRNA）通过碱基互补配对可以定位与靶向基因结合，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂，断裂的基因上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。回答下列问题：

（1）CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌体内，推测该系统在细菌体内的作用是___________________。

（2）基因表达载体的启动子位于________________，是RNA聚合酶识别和结合的部位。目的基因导入受体细胞后，成功产生了Cas9蛋白和gRNA。gRNA能够定位靶向基因的原理是________________。

（3）Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂，由于________________，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。从根本上剔除老鼠细胞中的目标基因（肥胖基因），常选用________________作为改良对象，理由是________________________________________________。

（4）科学家从癌症患者血液中提取某种细胞，利用基因编辑技术加入一个帮助这种细胞定向清除癌细胞的新基因序列，然后再把这些细胞注入患者血液中，以达到杀死癌症细胞的目的，这些细胞是人体的________________细胞，由于该细胞中的PD-1蛋白会引起免疫耐受，减弱对癌细胞的定向清除作用，临床上可以通过 CRISPR-Cas9技术剔除________________，从而重新激活淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击能力。

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