酿酒酵母不能利用木糖制约了利用植物原料生产乙醇的经济效益。木酮糖激酶是木糖转化、利用的关键...

酿酒酵母不能利用木糖制约了利用植物原料生产乙醇的经济效益。木酮糖激酶是木糖转化、利用的关键 酶，为提高酵母细胞中木酮糖激酶的表达量，科研人员将两种启动子与木酮糖激酶基因结合并导入酿酒酵母细胞，构建 能同时利用葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母。下图表示相关研究过程，表是几种限制性内切酶的识别序列及切割位 点。请回答：

（1）重组质粒中终止子的作用是 ____________________。表中切割 DNA 后形成相同黏性末端的限制性内切酶是__________________，黏性末端为___________ 。　　

（2）过程③使用的限制性内切酶是　 _________________。过程⑤需先用 LiAc 处理酿酒酵母细胞，其目的是 _________________________________ ，使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。

（3）结合图示分析，进行工程菌筛选时，在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒的酿酒酵母，这是因为 _____________________________________ 。

（4）研究人员对筛选得到的两种重组酵母(甲中导入启动子 A，乙中导入启动子 B)细胞中木酮糖激酶活力及发酵乙醇得率进行比较(发酵条件：1 L 15 g·L－1 的葡萄糖和 50 g·L－1 的木糖培养基中，120 h)结果如下表。

从木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的结论是启动子 A 的功能比启动子B____，但本实验中乙醇得率相差不大，其可能的原因是____。

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，科学家欲从果园的葡萄上或土壤中分离这种酵母菌，操作如下：

(1)获得酵母菌纯净培养物的关键是____________________。

(2)在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是__________________________。 划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，造成划线无菌落可能的操作失误是________________________________。

(3)将自然界中采集到的葡萄带回实验室，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后将瓶中的液体用涂布器涂布接种于以木糖为唯一________的固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间，获得能利用木糖的多个酵母菌菌落。

(4)若要检测土样中的酵母菌含量，应采用____________法。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________________。

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答：

(1)为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该将器皿__________________。下图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙指示的结构依次是_____________________________________。

(2)在制作牛肉膏蛋白胨培养基时，要求将称好的牛肉膏连同________一同放入烧杯，加入少量的水，加热。

(3)用高压灭菌锅灭菌后的培养基，需要冷却到____℃左右时，才能用来倒平板。你可以用________________________方法来估计培养基的温度。

(4)取从自然界中采集的葡萄，然后在超净台上将葡萄置于0.1%__________水溶液中进行表面消毒5 min，再用________将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后进行纯化培养。下图甲是经上述纯化培养的结果，在培养基上接种时划线的顺序依次是__________(用编号表示)。研究者在经过甲接种后得到了一个经培养后菌落分布如图乙所示的平板，推测接种时可能的操作失误是__________________________________________。

(5)下表为某学生在筛选培养能利用木糖发酵的酵母菌时所配制的培养基配方，请指出其中的明显不足之处________。

(6)在将目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上，并将所得的重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏________能力的酿酒酵母作为受体菌。

(7)将经上述流程培养获得的转基因酿酒酵母接种在含葡萄糖和木糖的培养基中进行酒精发酵能力测试。随着发酵的进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能____________________，即说明所需菌株培育成功。

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差．科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母．请分析回答下列问题：

（1）制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是 _________ ．

（2）取从自然界中采集的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后按图甲所示过程进行酵母菌的纯化培养．图乙是经过图甲过程A 纯化培养的结果，在培养基上接种时划线的顺序依次是 _________ （用编号表示）．研究者在图甲过程C 的操作培养过程中，得到了一个经培养后菌落分布如图丙所示的平板，推测接种时可能的操作失误是 _________ ．

（3）将培养基上的酵母菌菌株转接到仅以 _________ 为碳源的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵．

（4）从以上筛选得到的活酵母菌中提取DNA，利用PCR 技术大量扩增获得目的基因．若将1个目的基因分子复制10 次，则需要在缓冲液中至少加入 _________ 个引物．将目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上，然后将所得的重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏 _________ 能力的酿酒酵母作为受体菌．

（5）将经上述流程培育获得的转基因酿酒酵母接种在含 _________ 的培养基中进行酒精发酵能力测试．随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能 _________ ，即说明所需菌株培育成功．

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差．科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母．请分析回答下列问题：

（1）制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是 _________ ．

（2）取从自然界中采集的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后按图甲所示过程进行酵母菌的纯化培养．图乙是经过图甲过程A 纯化培养的结果，在培养基上接种时划线的顺序依次是 _________ （用编号表示）．研究者在图甲过程C 的操作培养过程中，得到了一个经培养后菌落分布如图丙所示的平板，推测接种时可能的操作失误是 _________ ．

（3）将培养基上的酵母菌菌株转接到仅以 _________ 　为碳源的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵．

（4）从以上筛选得到的活酵母菌中提取DNA，利用PCR 技术大量扩增获得目的基因．若将1个目的基因分子复制10 次，则需要在缓冲液中至少加入 _________ 个引物．将目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上，然后将所得的重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏 _________ 　能力的酿酒酵母作为受体菌．

（5）将经上述流程培育获得的转基因酿酒酵母接种在含 _________ 的培养基中进行酒精发酵能力测试．随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能 _________ ，即说明所需菌株培育成功．

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答下列问题:

(1) 制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是　　　　　　　　 。

(2) 取从自然界中采集的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后按图甲所示过程进行酵母菌的纯化培养。

图乙是经过图甲过程A 纯化培养的结果，在培养基上接种时划线的顺序依次是　　　　 (用编号表示)。研究者在图甲过程C 的操作培养过程中，得到了一个经培养后菌落分布如图丙所示的平板，推测接种时可能的操作失误是　　　　　　 。

(3)将培养基上的酵母菌菌株转接到　　　　　　　　 的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。从存活的酵母菌中提取DNA，经大量扩增获得目的基因。

(4)将目的基因连接到质粒上，该质粒具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因。将重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏　　　　　　　　 能力的酿酒酵母作为受体菌。

(5)将上述获得的转基因酿酒酵母接种在以　　　　　　　　 和　　　　　　　　 为碳源的培养基中进行发酵能力测试。随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能　　　　　　　　　 ，即所需菌株培育成功。

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答下列问题:

(1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是

_________________　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ___________。

(2)取从自然界中采集的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后按图甲所示过程进行酵母菌的纯化培养。

图乙是经过图甲过程A 纯化培养的结果，在培养基上接种时划线的顺序依次是________(用编号表示)。研究者在图甲过程C 的操作培养过程中，得到了一个经培养后菌落分布如图丙所示的平板，推测接种时可能的操作失误是_____________________________。

(3)将培养基上的酵母菌菌株转接到仅以____　　　　 ____ 为碳源的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。

(4)从以上筛选得到的活酵母菌中提取DNA ，利用PCR 技术大量扩增获得目的基因。若将1个目的基因分子复制10次，则需要在缓冲液中至少加入_____个引物。将目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上，然后将所得的重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏_______　　　　　　　 _ 能力的酿酒酵母作为受体菌。

(5)将经上述流程培育获得的转基因酿酒酵母接种在含__________的培养基中进行酒精发酵能力测试。随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能_______　　　　 ______，即说明所需菌株培育成功。

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常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答：

（1）微生物实验用的培养基的灭菌方法是__________；进行干热灭菌的物品应满足的条件是__________。

（2）自然界中采集葡萄，然后在超净台上将葡萄置于0．1%氯化汞水溶液中进行表面消毒5 min，再用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后进行纯化培养。再经过接种培养，得到的菌落分布如下图所示的平板，推测接种时可能的操作失误是________。为了确定培养基是否被污染，需要进行的操作是___________。

（3）下表为某学生在筛选培养能利用木糖发酵的酵母菌时所配置的培养基配方，请指出其中的明显不足之处______________。

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Ⅰ 常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能利用酶A分解木糖产生酒精。请分析回答下列问题：

(1)在制备含琼脂的培养基和倒平板的过程中，下列选项需要的是________(填序号)。

①酒精灯　②接种环　③高压蒸汽灭菌锅　④培养皿

(2)将自然界收集的酵母菌菌株转接到仅以_______为碳源的培养基中，________(填“有氧”或“无氧”)条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。

(3)将搜集到的酵母菌放入培养液中扩大培养后，用稀释涂布平板法计算每克样品中的菌株数的公式为(C÷V)×M，其中C代表________________。对于需要长期保存的菌种，可以采用________的方法。

Ⅱ 大肠杆菌的纯化包括制备牛肉膏蛋白胨培养基和纯化大肠杆菌两个环节，分析回答：

(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和 _____等条件。

(2)通常，对培养获得的纯菌种还可以依据菌落的形态、大小 _________和颜色等特征对细菌进行初步初步的鉴定和分类。要进一步鉴别大肠杆菌，还要根据微生物的代谢特点，在培养基中加入____________。

(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_______。

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生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物（秸秆）生产乙醇，其技术流程为：纤维素酶解→酵母发酵→蒸馏→成品。

（1）纤维素酶的成本能否下降，是能否实现乙醇工业化生产的关键因素。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌的实验流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→鉴别培养。

①最好选择怎样的环境采集土样？

________________________________________________________________________。

②以下是一种培养基配方：纤维素粉5 g、NaNO31 g、Na2HPO4·7H2O 1.2 g、KH2PO40.9 g、MgSO4·7H2O　 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪素0.5 g（蒸馏水定容到1 000 mL）该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原理是__________________。

③为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基上加入________染液，将筛选获得的菌液稀释后用________接种到鉴别培养基上，然后挑选产生________的菌落作为菌种进行扩大培养。

④纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢？请设计实验进行检测。

________________________________________________________________

（2）进行工业化酶解时，为了使纤维素酶能反复使用，可以采用____________技术。

（3）乙醇是酵母菌的发酵产物，发酵时酵母菌直接利用的物质是________。

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