萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的...

萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。

（1）研究者用相同的________酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到重组质粒，再将重组质粒置于经________处理的大肠杆菌细胞悬液中，获得转基因大肠杆菌。

（2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因。

①这是利用PCR技术实现了定点的________。

②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。

________

（3）研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和________分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用________方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断新蛋白A基因表达效率是否提高。为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较________的大小，以确定表达产物的生物活性大小。

（4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，其优点是________________。

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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是____。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和___________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是_________。

A．Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点

B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有___________，步骤③中需先用______处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是___________。

（4）用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数（植物受病毒侵染的严重程度）为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79。说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有__________。

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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是__________的特定碱基排列顺序。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和___________（填DNA序列），以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是_________。

A．Ti质粒内，限制酶的切割位点应位于T-DNA内

B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的元件还可以有____________，步骤③中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过_________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是①________________________②_____________________________。

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Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因，因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的基因。请回答下列有关转基因抗虫植物的问题：

（1）要从苏云金芽孢杆菌中获取Bt毒蛋白基因，可根据Bt毒蛋白基因的部分已知序列， 设计特异性　　　　　　　　　　 ，再利用　　　　　　　　 技术扩增出Bt毒蛋白基因。

（2）构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有_____，它能把目的基因整合到受体细胞（植株细胞）的______上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是　　　　　　　　　　　　 法。

（3）要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做________实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应毒蛋白，在分子水平上可利用________________方法进行检测。

（4）目前，转基因植物的安全性问题是社会争论的热点。如有些人认为转基因植物的种植会威胁环境安全；但也有人认为转基因植物的种植减少了　　　　　　　　 的使用，有利于减轻污染。面对转基因技术的利弊，我们应持有的正确做法是___　　　　　　　　　　　　　　 ________。

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基因工程在农牧业和医药卫生等方面具有广泛的应用，并影响和改变着我们的生活。下列相关叙述错误的是（　　 ）

A.从大肠杆菌培养液中提纯的胰岛素的生物活性与人体中的完全相同

B.Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因等是主要的抗虫基因

C.基因治疗是一种把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能而达到治病目的的技术

D.某些转基因动物可通过分泌乳汁来生产所需的药品

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Bt基因即是苏云金芽孢杆菌(Badcillus thuringiensis,简称Bt)基因,因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。下图为培育转Bt基因苗的基本操作过程。

(1)Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取,也可以从其cDNA文库中获取,若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因（若Bt基因序列已知）,则在PCR体系中需加入的引物序列通常为____种。

(2)在构建基因表达载体的过程中,为了方便筛选含有目的基因的细胞,作为载体的Ti质粒应含有____基因,其中____是驱动基因转录的酶识别和结合的位点,而能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列称为______。图示将目的基因导入受体细胞的方法是_______。

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Bt基因即苏云金芽胞杆菌基因，因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。下图为培育转Bt基因抗虫棉幼苗的基本操作过程，请分析回答：

（1）Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取，也可以从其cDNA文库中获取。从前者获取的Bt基因______(含有/不含有)启动子。

（2）若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因（基因序列未知），需根据Bt蛋白氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是__________________。在PCR体系中需加入其中的_________(全部/任意1种/其中2种)引物。若Bt基因序列已知，则引物的序列通常为__________种。

（3）在构建基因表达载体的过程中，为了方便筛选含有目的基因的细胞，作为运载体的Ti质粒应含有____________，Ti质粒中能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列称为__________，图中将目的基因导入受体细胞的方法称为____________。

（4）长期大面积种植转Bt基因抗虫棉可能对环境造成影响，请就某一种间关系指出转Bt基因抗虫棉可能对环境造成的不利影响（要求说出某一种间关系的名称并相应说出可能造成的不利影响）。_________________________________。

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钙依赖蛋白激酶（CDPK）在植物的信号传导和提高植物抗性方面发挥着重要作用，科学家通过将CDPK基因导入拟南芥中，来获得具有抗性的新品种。下图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图，图中标记了限制酶的切割位点。回答下列问题。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_______________，为了使CDPK基因插入质粒中，应选取________________两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段。

（2）将获取的CDPK基因进行PCR扩增，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶主要原因是_____________________________________。

（3）图中所示的质粒为Ti质粒，操作过程中需要把CDFK基因插入到质粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在转化中的作用是____________________________。为了检测CDPK基因是否导入成功，可以用________________________________作探针检测CDPK基因是否导入拟南芥细胞，导入成功的标志是________________ 。

（4）为研究CDPK基因表达载体对拟南芥的遗传转化的影响，将转化后的拟南芥植株生长成熟后，采集其种子，播种于含________________________的MS培养基中进行抗性筛选。

（5）基因工程的核心是_________________　 ，目的是 ____________________________。

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我国科学家利用Bt毒蛋白基因转入普通棉花，培育出转基因的抗虫棉，对棉铃虫有较强抗性。回答下列问题：

（1）从苏云金芽孢杆菌中分离出Bt毒蛋白基因，构建基因表达载体导入棉花细胞。获得的抗虫棉也能产生相同的Bt毒蛋白，从翻译的角度分析,其原理是___________________________________。

（2）从分子水平检测抗虫棉是否培育成功，可以利用抗原-抗体杂交来检测。若有__________出现，说明已形成Bt毒蛋白。在该检测方法中，Bt毒蛋白属于____________ 。

（3）从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功，取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，对照组如何设置：_______________________________。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。获得的抗虫棉若要扩大生产， 可以通过_________________________ 技术进行微型繁殖。

（4）在农业生产中，抗虫棉大面积种植的区域还需配套种植一定量的普通棉花，从进化的角度分析，原因是__________________________________________________________________ 。

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Bt基因即是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)基因，因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。下图为培育转Bt基因苗的基本操作过程。

（1）Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取，也可以从其cDNA文库中获取，从后者获取的基因________（填“含有”或“不含有”）启动子。若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因（基因序列未知），需根据Bt蛋白氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是________________________________在PCR体系中需加入其中的________（填“全部”或“任意1种”或 “其中2种”）引物。若Bt基因序列已知，则引物的序列通常为________种。

（2）在构建基因表达载体的过程中，农杆菌中的______作为载体，能作为载体的必需具有哪些特点______________________________________________（答出2点），而能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列称为 ______ 。图示中将目的基因导入受体细胞的方法是________________。

（3）步骤Ⅴ和Ⅳ过程要注意控制培养基中___________________ 的浓度比例，以便获得幼苗。

（4）若获得的转基因植株（Bt基因已经整合到植物的基因组中）抗虫的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是___________________。

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