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酵母菌的蛋白质可作为饲料蛋白的来源，有些酵母菌能以工业废甲醇作为碳源，研究人员拟从土壤样品中分离出可利用工业废甲醇的酵母菌，这样既能减少污染又可变废为宝。下图为主要操作流程示意图。
回答下列问题：
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的____，及时对培养基进行分装，并进行高压蒸汽灭菌：在加热排除高压锅内原有的____后，将高压锅密闭，继续加热，通常在____的条件下，维持15-30min，可达到良好的灭菌效果。
（2）取步骤②中梯度稀释后的适量液体加入无菌培养皿，然后将高压蒸汽灭菌后的培养基冷却至____（25℃/50℃/80℃）左右时倒入培养皿混匀（步骤⑧），冷凝后将培养皿倒置，在适宜的条件下培养一段时间。
（3）挑取平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线纯化，下列叙述合理的是____。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
c．划线时不能划破培养基表面，以确保能正常形成菌落
d．第二区以后的划线起始端要与上一区的划线的末端相连接，最后一区的划线末端不能与第一区的划线相连
（4）步骤⑤的培养中，应加入 ___作为碳源，并加入适量的氮源、无机盐和水等成分。为监测发酵罐中酵母菌活细胞的密度，取2mL发酵液稀释1000倍后，加入等体积台盼蓝染液染色，用如图所示的计数室规格为25x16型的血细胞计数板计数，要达到每毫升4x109个活酵母菌细胞的预期密度，理论上，图中标号①～⑤五个中格里的呈____色的酵母菌细胞总数应不少于____个。
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酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的____________________，及时对培养基进行分装，并进行____________________灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_______________（在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有___________________。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
（4）步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和__________________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_______色细胞的个数应不少于__________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
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有些酵母菌可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母并进行扩大培养，下图所示为操作流程。请回答下列问题：
(1)在配制培养基过程中，对培养基应采用____灭菌。若需要调节培养基的pH，应在灭菌_______（填“前”或“后”）进行。
(2)在步骤③中将温度大约为____（填“25℃”或“50℃”或“80℃”）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。为判断实验中的培养基是否起到了选择作用，可用含甲醇和其他碳源的培养基作对照组重复步骤③，若对照组的菌落数目明显____（填“大于”、“等于”、“小于”）实验组，则说明起到了选择作用。
(3)在操作④中划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，其他区域的划线上却均无菌落。操作失误的原因可能是____。
(4)为重复利用筛选出的酵母，用海藻酸钠和氯化钙制成了包埋酵母的多孔状凝胶珠。实验表明：凝胶珠孔径太大或太小，发酵效率都很低。请简要分析其原因______________。
(5)酵母菌分解甲醇与某种蛋白质类酶密切相关，研究人员拟用凝胶色谱法从酵母菌蛋白质提取液中分离出该酶。在装填凝胶时要尽量紧密，不得有气泡存在。因为气泡会______________，降低分离效果。
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有些酵母菌可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母并进行扩大培养，下图所示为操作流程。请回答下列问题：
(1)在配制培养基过程中，对培养基应采用____灭菌。若需要调节培养基的pH，应在灭菌_______（填“前”或“后”）进行。
(2)在步骤③中将温度大约为____（填“25℃”或“50℃”或“80℃”）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。为判断实验中的培养基是否起到了选择作用，可用含甲醇和其他碳源的培养基作对照组重复步骤③，若对照组的菌落数目明显____（填“大于”、“等于”、“小于”）实验组，则说明起到了选择作用。
(3)在操作④中划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，其他区域的划线上却均无菌落。操作失误的原因可能是____。
(4)为重复利用筛选出的酵母，用海藻酸钠和氯化钙制成了包埋酵母的多孔状凝胶珠。实验表明：凝胶珠孔径太大或太小，发酵效率都很低。请简要分析其原因______________。
(5)酵母菌分解甲醇与某种蛋白质类酶密切相关，研究人员拟用凝胶色谱法从酵母菌蛋白质提取液中分离出该酶。在装填凝胶时要尽量紧密，不得有气泡存在。因为气泡会______________，降低分离效果。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1 巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5'AOX1和3'AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。
资料2 巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上______、______限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取_______ _。
(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用_____ ___方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____ ____以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
(6)与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___ _____并分泌到细胞外，便于提取。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1 巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时AOX1基因也会因受到诱导而表达[5’AOX1和3’AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。
资料2 巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________、_______限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取________________。
(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用__________________方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
(6)与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行________并分泌到细胞外，便于提取。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了如图所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________________、 ____________限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。
（3）步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中HBsAg基因是否转录出mRNA，可以用____________方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行____________并分泌到细胞外，便于提取。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1 巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5'AOX1和3'AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。
资料2 巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上______、______限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取_______ _。
(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用_____ ___方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____ ____以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
(6)与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___ _____并分泌到细胞外，便于提取。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了如图所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________________、 ____________限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。
（3）步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中HBsAg基因是否转录出mRNA，可以用____________方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行____________并分泌到细胞外，便于提取。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了如图所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________________、 ____________限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。
（3）步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中HBsAg基因是否转录出mRNA，可以用____________方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行____________并分泌到细胞外，便于提取。