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【生物——现代生物科技专题】S多肽是构成乙肝病毒的主要成分，现利用基因工程制造乙肝疫苗。回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增S基因前，需根据S基因的核苷酸序列设计____种引物，进行PCR时需加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，此操作的目的是____。

(2)将S基因插入Ti质粒中（如图所示）构建基因表达载体时，需要在S基因前后两端分别引入____的酶切位点，目的是 ___（答出一点即可）。

(3)用分子杂交技术检测S基因是否转录出mRNA的具体操作过程是____，若____，则表明转录出了mRNA。

(4)乙肝疫苗的接种需要在一定时期内间隔注射3次，其目的是使机体产生更多的___________。

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[生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）

将乙肝病毒表面抗原基因导入草莓细胞中，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，为预防乙肝开辟了一条新途径。请回答下列问题：

（1）获得乙肝病毒表面抗原基因后，常利用_________________技术进行扩增。把基因转入农杆菌内时常用_________________处理农杆菌，使之成为感受态细胞。

（2）使用农杆菌将乙肝病毒表面抗原基因导入草莓细胞中，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可将乙肝病毒表面抗原基因转移至草莓细胞中的_________________上。目的基因进入草莓细胞内并在草莓细胞内维持稳定和表达，这个过程称为_________________。

（3）在基因工程操作过程中，需要用_________________酶和_________________酶构建基因表达载体，基因表达载体要有_________________，以便筛选出含有目的基因的受体细胞。

（4）在分子水平上，可采用_______________的方法来检测转基因草莓果实提取液中有无相应的抗原。

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(12分)【生物——现代生物科技专题】我国目前临床使用的乙肝疫苗大多为基因工程疫苗，其有效成分是乙肝表面抗原蛋白。下图是将乙肝表面抗原基因转移到烟草细胞内生产乙肝疫苗的示意图，请据图回答：

(1)过程①表示_________。为了使目的基因正常表达，其首端必须有______识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端，要选择___________进行连接。

(2)目的基因通过过程②进入农杆菌细胞内，并在农杆菌细胞内维持稳定和表达的过程称为___________。

(3)将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞的方法称为________________。

(4)将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞后，需要进行基因的检测与鉴定：首先检测____是否插入了乙肝表面抗原基因；其次检测_____是否转录出相应的mRNA；最后检测乙肝表面抗原基因是否翻译出乙肝表面抗原蛋白，检测的方法是____________。

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乙肝病毒（HBV）是部分双链的DNA病毒，乙肝病毒引起的乙型肝炎不仅感染性高，而且危害大。下面是利用现代生物技术治疗乙型肝炎的三种方法。请回答下列问题：

（1）方法Ⅰ属于使用基因工程方法进行治疗，可以用___________技术扩增HBV表面抗原基因。过程①不仅需要构建___________，还需要对酵母菌进行处理，使其成为___________细胞，可通过___________技术确定转基因酵母菌是否培养成功。

（2）方法Ⅱ中，培养细胞1时，培养液中除应含有细胞所需的营养物质外，还应添加___________等一些天然成分，经过选择性培养得到的细胞2还需进行克隆化培养和___________检测，再经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。与植物细胞融合相比，过程②特有的方法是用___________处理。

（3）方法Ⅲ运用的是现在流行的基因编辑技术——CRISPR/Cas9系统，科学家借助纳米脂质颗粒将Cas9蛋白的mRNA和引导RNA通过___________方式送入肝细胞内，然后Cas9mRNA经翻译合成Cas9蛋白，接着Cas9蛋白和引导RNA组装成 CRISPR/Ca59系统进入细胞核中，将整合在染色体上的乙肝病毒DNA进行基因编辑，使病毒DNA___________。由此可推测，CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白可能是切割病毒DNA___________键的酶。

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回答有关现代生物技术的问题

乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种慢性传染病，主要采用基因工程乙肝疫苗进行防治。科研人员采用转基因技术将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因片段导入酵母细胞或中国仓鼠卵巢细胞（CHO），让重组后的酵母或CHO细胞在体外培养过程中产生HBsAg，将其分离、提纯之后制成乙肝疫苗，部分生产过程如图。

（1）下列①～④表示获得重组CHO细胞的步骤，其中步骤④是______；①-④步骤的正确排序是______。

①重组DNA分子导入CHO细胞

②筛选成功导入HBsAg基因的CHO细胞

③人工合成HBsAg基因

④______

（2）大量培养重组酵母和重组CHO细胞生产乙肝疫苗过程中，需将培养液中HBsAg与其他杂质分离，可采用的方法是______（多选）。

A．破碎细胞 B．加入硫酸铵 C．改变pH D．冷冻干燥

（3）利用重组酵母和重组CHO细胞生产乙肝疫苗，分别属于生物工程中的______、______领域。

（4）利用重组CHO细胞和重组酵母生产基因工程乙肝疫苗，目前都在进行规模化生产，但两种方法各有不足和优势。请在下列选项中选择合适的编号填入表对应的空格中，以表示你对此问题的分析（编号可重复选用）：

①结构简单、遗传操作较为容易

②表达的HBsAg更接近天然形式，疫苗稳定性好

③表达的HBsAg与天然形式存在差异

④培养条件要求高，生产成本较高

⑤可将HBsAg分泌到胞外，易于分离提纯

⑥易于培养、繁殖迅速，生产成本较低

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[生物一一选修3:现代生物科技专题]口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗。请回答下列问题：

（1）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，则获得可重组到质粒的VP1基因必须用到________酶。要获得大量该VP1基因，可利用____________技术进行扩增。

（2）下图是插入VP1基因的农杆菌Ti重组质粒结构示意图，构建具有VP1基因的基因表达载体还需要在质粒中插入____________。

（3）VP1基因应插入到农杆菌Ti质粒的__________上，通过___________作用进入番茄细胞并插入到染色体DNA，使VP1基因能够稳定维持并发挥作用。

（4）通常用BamHⅠ、HindⅢ两种限制酶切割VP1基因和Ti质粒的目的是_____________；要筛选出含有该目的基因表达载体的番茄细胞，首先需要在含的_____________培养基上进行。

（5）检测发现染色体DNA上插入VP1基因的某些番茄细胞死亡了，导致这些转基因番茄细胞死亡的最可能原因是______________________。

（6）将成功转入VP1基因的受体细胞进行培养，获得转基因植株。若要快速繁殖大量这种转基因种苗，应选取幼枝的_____________部位进行组织培养。

（7）获得表达VP1蛋白的番茄植株以后，要进行免疫效力的测定，具体方法是：将从转基因番茄叶片中提取的VP1蛋白质注射到一定数量的豚鼠体内，每半个月注射一次，三次注射后检测豚鼠血液中产生的

_______________数量，为了使结果可信，应设置空白对照组，注射等量生理盐水。

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【生物选修3-现代生物科技专题】狂犬病的病原体为RNA病毒，其表面的G蛋白可作为主要抗原用于制备狂犬疫苗，研究人员利用生物工程技术培育出转G基因番茄，实现G蛋白的大量生产。其基本技术流程如下图。请回答：

（1）图中过程①称为______；用PCR扩增方法获取G基因，则需要用到______酶，该方法能够成功获取G基因的前提是_____________________，以便合成引物。过程②采用最多的方法是______。

（2）图中N称为______；过程③称为______。

（3）食用G基因已有效表达的转基因番茄果实______（能/不能）预防狂犬病。原因是_____________。

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研究人员将乙肝病毒的表面抗原（HBsAg)基因转入番茄幼叶细胞中，获得能产生乙肝疫苗的番茄植株。回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增HBsAg基因时，目的基因DNA受热变性后的单链与引物互补序列结合，在_______酶的作用下进行延伸。设计的引物含有ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点，用作载体的DNA分子________(填“含有”或“不含有”）ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点，理由是________________。

（2）将HBsAg基因导入番茄幼叶细胞最常用的方法是______________，该方法可以使目的基因插入到细胞中______________的DNA上。

（3）可利用植物组织培养技术获得转基因番茄植株，该技术利用的原理是________________。

（4）通过电镜对番茄果实提取物进行观察，发现了HBsAg颗粒，说明目的基因导入受体细胞后_________。用获得的转基因番茄果实饲喂小鼠，如果在小鼠血清中检测到_____________，说明转基因植物疫苗可口服。

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用基因工程技术将乙肝病毒的蛋白A基因导入酵母菌细胞，可以大规模的生产乙肝疫苗，请回答下列相关问题：

（1）利用PCR技术扩增蛋白A基因时，需要在一定的缓冲溶液中进行，目的是____________________。反应体系中除了含有蛋白A基因、脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、还必须含有分別与两条模板链相结含的____________。

（2）大规模培养工程酵母菌时，培养液中需含有水、无机盐、碳源、氮源等营养物质，培养过程中还需通入无菌空气，目的是_______________________。

（3）利用凝胶色谱法从工程酵母菌中分离蛋白A时，凝胶色谱柱装填完毕后需立即连接缓冲液洗脱瓶，一段时间后加入蛋白A粗提样品进行洗脱。立即连接缓冲液洗脱瓶的目的是____________，若蛋白A的分子量较小，则洗脱时间相对____________（较短、较长）。

（4）以乙肝病毒蛋白A作为疫苗给人注射时，必须分多次进行，两次注射之间必须间隔一定的时间，目的是让人体____________；通过注射该疫苗无法预防流感病毒，原因是________________________。

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[生物——选修3：现代生物科技专题]

请回答下列与基因工程、胚胎工程、生态工程有关的生物学问题：

(1)基因工程技术中获得目的基因后，利用PCR技术将该基因扩增，前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是_______________。

(2)体外受精是胚胎工程的重要环节，受精前的准备阶段：取自附睾的精子要进行精子获能；来自母方的卵母细胞要在输卵管内进一步成熟，达到______________，才具备与精子受精的能力。胚胎工程最后一道工序是___________（填生物技术名称）。

(3)与传统方法生成的抗体相比，单克隆抗体具有很多优点。在癌症治疗时，把抗癌细胞的单克隆抗体与放射性同位素相结合，制成“生物导弹”，借助单克隆抗体的__________作用，将药物带到癌细胞位置，将其在原位杀死。单克隆抗体的制备过程主要应用了________________技术

(4)桑基鱼塘生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成无废弃物农业，这主要遵循了生态工程____________的原理。我国西北一些地区年降雨量较少，适宜种植灌木和草，却被硬性规定种植属于乔木的杨树，致使许多地方的杨树长成半死不活状，结果防护林成为残败的“灰色长城”。其失败的原因主要是违背了____________原理。

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