目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT-PCR技术。RT-PCR是将RNA逆转录...

目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT-PCR技术。RT-PCR是将RNA逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。下列说法错误的是（　　 ）

A.与该mRNA结合的引物，可以是A也可以是B

B.引物A与引物B的基本单位都是脱氧核苷酸

C.过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增

D.该反应体系中应加入逆转录酶、Taq酶等物质

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新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT-PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是（　　 ）

A.过程①以mRNA为模板合成单链DNA

B.过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要n个引物B

C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度

D.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3＇端开始连接

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新型冠状病毒是一种单链 RNA 病毒，新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。

（1）首先，从样本中提取病毒RNA，经_____酶作用生成cDNA。然后以cDNA为模板 进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。

（2）通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图 1）。

① 当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火，通过形成_____而特异性结合。

② 在 PCR 循环的_____阶段，TaqDNA 聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强

（3）在通过实时荧光 PCR 检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图 2 所示。

① 与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有_____。

② Ct 值的含义：在 PCR 扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就_____。

③ 某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37 判定为阳性，Ct>40 或无 Ct 值判定为阴性。图 2 所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为_____。

（4）阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有_____。

a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光 PCR 检测阈值

b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解

c．病毒发生变异

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实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针 和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发岀的淬灭基团，新链 延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发岀荧光。利用 RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（　　 ）

A.RT-PCR技术需要用到逆转录酶和Taq酶

B.PCR过程中需加入两种引物和4种dNTP

C.引物和探针都需与目的基因进行碱基互补配对

D.若检测结果没有荧光发岀，说明被检测者感染了病毒

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2019年底，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发，其病原体与2003年引起SARS爆发的冠状病毒相似，世界病毒学会将其定名为SARS-COV-2。目前已有累计超过450万人被确诊，死亡人数超过30万人，这一数字仍在快速增长。目前核酸检测依然是患者临床确诊和康复出院的重要依据。请回答：

（1）下图表示SARS-CoV-2病毒检测的部分流程。科学家以病毒的RNA为模板通过①_______过程合成cDNA，再对cDNA进行PCR扩增，这项技术称为RT-PCR。

（2）进行RT-PCR需要加入的酶是__________________，要从cDNA中扩增出新冠病毒特有的基因序列ORF1ab和核壳蛋白基因N关键在于要加入__________、dNTP及所需的酶一起构成反应体系。

（3）RT-PCR加入Taqman荧光探针可以通过测定荧光强度来检测产物浓度，原理如下：Taqman荧光探针为一段与_____________互补的核苷酸单链，两端分别连接一个荧光基团R和一个淬灭基团Q。探针结构完整时，R发射的荧光被Q吸收；而PCR扩增时结合在模板链上的探针被切断，使R和Q分离，R基团发射的荧光不被淬灭，这样通过对荧光信号强弱的监测就可实现对产物的检测。一个DNA经PCR技术扩增n次，需要消耗引物_________个。

（4）一次核酸检测历时需16小时，为快速检测可采用抗原-抗体杂交技术，这一技术的关键是要生产出能与新冠病毒结合的特异性抗体．请写出生产这种抗体的思路：____________________________________________________________。

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2019年底爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的，能否快速、准确地检测出病原体成为疾病防控的关键。回答下列问题。

（1）科学家以病毒的RNA为模板通过__________过程合成cDNA，再对cDNA进行PCR扩增，这项技术称为RT-PCR。

（2）RT-PCR加入Taqman荧光探针可以通过测定荧光强度来检测产物浓度，原理如下：Taqman荧光探针为一段与___________互补的核苷酸单链、两端分别连接一个荧光基团R和一个淬灭基团Q。探针结构完整时，R发射的荧光被Q吸收；而PCR扩增时结合在模板链上的探针被切断，使R和Q分离，R基团发射的荧光不被淬灭，于是随着DNA扩增次数的增加，荧光的强度会逐渐__________（填“增大”或“减小”），这样通过对荧光信号强弱的监测就可实现对PCR产物的检测。

（3）新型冠状病毒和SARS病毒都会造成肺炎。下图是SARS-CoVS蛋白（SARS病毒的刺突蛋白）单克隆抗体的制备过程。

已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。鼠的淋巴细胞有上述两种途径，但一般不分裂增殖；鼠的骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖。根据该原理，在含甲的混合培养液中添加氨基嘌呤__________（填“能”或“不能”）筛选出A，原因是__________。在SARS-CoVS蛋白（SARS病毒的刺突蛋白）单克隆抗体的制备过程中，需要用到动物细胞培养技术，应定期更换培养液，其目的是__________；在培养甲的过程中通常在合成培养基中加入血清、血浆等一些天然成分，其原因是___________。

（4）根据月前的研究推测，SARS-CoVS蛋白单克隆抗体__________（填“能”或“不能”）对新型冠状病毒发挥作用，理由是__________。

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（一）中国女科学家屠呦呦因研制的抗疟药青蒿素挽救了数百万人的生命，而获2015年诺贝尔生理医学奖。研究人员已经弄清了青蒿细胞中青蒿素的合成途径，如下图所示，请回答有关问题。

（1）图中②表示_______过程，需要______作为原料。

（2）科学家发现酵母细胞中也含有FPP， 但不能直接合成青蒿素，如要培育能产生青蒿素的酵母细胞，需要向酵母细胞中导入______________________基因。若已知目的基因的一小段核苷酸序列，则获得该基因的方法是________。

（3）培育能产生青蒿素的酵母菌属于基因工程，核心步骤是_______， 构建基因表达载体时，必须使用______和______两种工具酶。表达载体应该含有________酶识别和结合的部位，以驱动目的基因的转录，该部位称为________。

（4）为检测转基因酵母菌中的目的基因是否转录了出所需的mRNA，可采用____方法。

（二）2020年初，武汉出现了不明原因的肺炎，经检测是由一种新型冠状病毒（NCP）引起的，目前的检测手段主要是利用荧光PCR试剂盒或IgM 抗体快速检测试剂盒，科研人员正在加紧研制生产NCP的疫苗和探索相应抗体的制备。回答有关的问题：

（1）该病毒的遗传物质是_______，运用荧光PCR试剂盒对新冠病毒核酸进行检测，原理是提取病人体液样本中的RNA，进行反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），该过程需要_______酶和________酶。

（2）科研人员提出用康复者血清治疗新冠型肺炎，是因为康复者血清中存在_______（填“抗原”或“抗体”），但血清成分复杂，易引起受体出现_________，所以该方法存在缺陷。

（3）针对血清治疗存在的缺陷，研究者从治愈患者捐献的血液中提取浆细胞，然后用___________诱导该细胞和骨髓瘤细胞发生融合。几经努力，最终生产出单克隆抗体，此种方法生产的抗体具有______________________的优点。

（4）虽说我国疫情现已得到了很好的控制，但随着各地复工复产，人员不断流动，偶尔仍会出现几例本土病例的报道，结合所学知识，请你谈一下我们该如何预防？________________________________________。

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研究发现，肆虐全球的新型冠状病毒（2019-nCoV）为有包膜病毒，基因组为单股正链RNA，长度为29．8Kb。基于其特异性的基因组序列，科研工作者研制的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）为新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控提供了快速、简便、精准的核酸检测方案。RT-PCR荧光探针法即实时荧光定量PCR技术（Real Time Quantitative PCR），通过荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品通过检测荧光信号的累积（以Ct值表示）来确定样本中是否有病毒核酸。新型冠状病毒检测的具体操作过程如下图。根据所学知识，请回答下列相关问题：

（1）新型冠状病毒（2019-nCoV）的相关蛋白能在宿主细胞中正常表达的理论基础是________________________________。

（2）该反应体系中，过程①需要用到___________酶，在该体系中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。

（3）过程③使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是___________，其作用是破坏了DNA双链分子中的___，引物Ａ、Ｂ的作用是_____________。

（4）采集新冠肺炎疑似患者的咽部细胞样本提取核酸进行上述ＲＴ－PCR过程，每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的目的基因越多，观察到的Ct值就越_________。

（5）RNA病毒分两类，一类以自身RNA为模板直接进行RNA的复制；另一类以自身RNA为模板逆转录合成DNA，再以DNA为模板合成RNA，即逆转录病毒。请利用同位素标记法设计实验证明新型冠状病毒是否是逆转录病毒________________。（现有放射性同位素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸及其他必要试剂，请简要写出实验思路）

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新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的核酸检测采用逆转录PCR技术。将待测样本处理后，先将样本RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。请回答下列问题：

（1）样本RNA逆转录成cDNA的原料是________________。

（2）逆转录PCR反应中使用的DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（ Taq）中分离提取的，与普通DNA聚合酶相比，该酶的特点是__________________。

（3） PCR-般要经历三十多次循环，每次循环可以分为_____________、_______________和延伸三步。在循环之前，常要进行一次______________，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。

（4）下表是用于新冠病毒的cDNA扩增的两种引物序列，请据表回答相关问题：

①引物1方框内对应的模板链序列为_______________。

②下图为cDNA的部分序列，请问引物1和引物2分别对应的位置是_____________。

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H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型RNA流感病毒，目前最为快速有效的检测手段是RT-PCR核酸检测。RT-PCR的过程包括反转录作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板进行扩增，过程如下图所示。据此分析下列问题

（1）传统PCR技术的原理是_________，过程中低温退火的含义是____________________。

（2）在RT-PCR中每一步都有酶的参与，上图中过程1中的关键酶是___________；PCR中的关键酶是_____________，该酶的作用特点是_____________、_________________

________________________________。

（3）在对病毒核酸进行检测时，主要通过RT-PCR扩增其关键的基因序列，这时引物的设计就非常关键，根据下图分析，请你选择合适的引物____________。

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