图是从大肠杆菌细胞中分离的质粒结构的示意图，利用质粒构建基因表达载体，可生产人胰岛素用于临...

图是从大肠杆菌细胞中分离的质粒结构的示意图，利用质粒构建基因表达载体，可生产人胰岛素用于临床治疗。请回答下列问题：

（1）人胰岛素基因不能从基因组文库中提取，而一般在DNA文库或用人工合成的方法获得，因为人胰岛素基因含有不编码蛋白质的__________，在原核细胞中不能表达。

（2）构建重组质粒时，应用两种__________对目的基因、质粒进行切割，形成特定的黏性末端，防止目的基因自身环化、空载质粒形成、__________，以提高构建重组质粒的效率。

（3）图中启动子是__________识别和结合的DNA片段。

（4）已知胰岛素是由A链、B链组成的蛋白质类激素，利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素时，先让β-半乳糖苷酶基因与胰岛素基因融合表达使胰岛素的蛋白酶作用位点被保护起来，再通过化学方法连接A链和B链，从而得到有功能的胰岛素。请简要说明这样做的原因：__________。

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阅读下面的材料，回答问题

胰岛素的应用是糖尿病治疗历史上的一个里程碑。胰岛素自1922年用于临床以来，就成为治疗糖尿病的特效药物。目前全世界糖尿病患者已超过四亿，为临床提供充足、质量可靠的胰岛素制剂是现代生物制药领域的一项重要工程。

人胰岛素由胰岛 β 细胞合成，核糖体上最初形成的是前胰岛素原单链多肽，进入内质网腔后，信号肽被切除，形成胰岛素原。高尔基体内的特异性肽酶将胰岛素原的 C 肽区域切除，A 链和 B 链通过二硫键形成共价交联的活性胰岛素（如图）。

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最初用于临床的胰岛素几乎都是从猪、牛胰脏中提取的。猪、牛胰岛素与人胰岛素生理功能相似，但氨基酸序列有微小差异。接受动物胰岛素治疗的患者有5％～10％出现不同程度的过敏反应，抗动物胰岛素抗体还可能对患者的胰岛 β 细胞功能产生负面影响。

随着基因工程技术的发展，重组人胰岛素逐渐取代动物胰岛素。早期的重组人胰岛素生产，采用A、B链分别表达法。后来该方法被胰岛素原表达法取代，即由大肠杆菌合成胰岛素原，然后经细胞外酶切获得胰岛素。1987年用酵母菌生产重组人胰岛素的方法出现。重组人胰岛素的结构与人体自身分泌的胰岛素结构完全相同，但无法完全模拟生理胰岛素曲线，容易导致血糖波动，甚至导致低血糖发生。

上世纪90年代，科学家通过改变胰岛素的氨基酸序列和结构，研制出能更好模拟生理胰岛素分泌特点的胰岛素类似物，包括速效胰岛素和长效胰岛素类似物。例如，将人胰岛素 B 链第28位的脯氨酸替换为天门冬氨酸，可有效抑制胰岛素单体的聚合，皮下注射这种速效胰岛素类似物后，起效快（10-20分钟起效）、血药浓度峰值高、药效消失快，已经在临床上广泛应用。

（1）用猪胰岛素进行治疗，易诱导人体产生抗猪胰岛素抗体，原因是_____。

（2）人胰岛素基因有 2 个内含子。利用大肠杆菌通过胰岛素原法生产重组人胰岛素，获取目的基因时，不宜采用的方法是_____

a．直接从细胞内总 DNA 中分离目的基因

b．用化学方法直接人工合成目的基因

c．以 mRNA 为模板逆转录合成目的基因

d．利用 PCR 扩增人胰岛素原基因的编码序列

（3）与大肠杆菌相比，利用酵母菌生产胰岛素的优势有_____。

（4）重组人胰岛素工程菌构建完成后，还需要通过_____工程技术进行胰岛素的生产。

（5）正常人胰岛素的生理性分泌，可分为基础胰岛素分泌（24小时持续脉冲式分泌微量胰岛素，维持空腹状态下血糖稳定）和进餐后的胰岛素分泌。能更好地模拟餐时生理胰岛素曲线的是_____（选填速效或长效）胰岛素类似物。

（6）请写出通过蛋白质工程，构建胰岛素类似物工程菌的基本过程_______________________。

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利用生物工程技术，可从转基因奶山羊乳汁中分离获得人凝血因子IV，用于血友病的治疗。请回答下列问题：

（1）根据凝血因子IV基因上游和下游的碱基序列，可用 ___技术获取并扩增基因。构建该基因表达载体时，所用到的工具酶是__，该基因表达载体中，凝血因子Ⅳ基因的上游和下游分别__。

（2）将目的基因表达载体导入奶山羊受精卵的常用方法是___。受体细胞选用受精卵的优点是细胞大易操作、营养物质含量高和___。

（3）在体外胚胎培养时，应选用囊胚的 ___进行DNA分析，用于选择雌性胚胎。此期的胚胎也适于胚胎分割移植，此技术的优点是_____。

（4）人凝血因子IV是一种胞外酶，该蛋白的加工是在___等细胞器上进行的。人凝血因子IV只在乳腺细胞合成的原因是___________________。

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下图是利用基因工程办法生产人白细胞干扰素的基本过程图，据图回答：

（1）①过程需要_______酶的参与。该酶的专一性很强，能别DNA分子中特定的_______序列，并使两条链中特定部位的_______________键断开。

（2）②物质是从大肠杆菌a中分离出的质粒，其化学本质是_______（填“DNA”或“RNA”）。

（3）一般将受体大肠杆菌b用 _________处理，使细胞处于能吸收周围环境中的DNA的生理状态，称为_____________细胞。

（4）构建的表达载体（重组质粒），除含目的基因外，还必须有_________、________和标记基因等。

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请根据人们利用转基因生产多种药物的技术，回答下列回题：

(1)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建基因表达载体中，含有人的胰岛素基因及启动子、___________、 ___________、复制原点等，其中启动子是___________识别和结合的部位，在转化大肠杆菌时，常用_____处理以使大肠杆菌成为__________细胞，以利于表达载体进入。为了检测胰岛素基因是否转录，可用标记的________作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为___________技术。常用____________技术检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译。

(2)利用烟草生产人的干扰素时，可以采用农杆菌转化法、__________法或_________法将目的基因导入受体细胞。当采用农杆菌转化法时，所选用的载体一般是________。转化成功后，还需利用_________技术将之培养成完整植株，该项技术的理论基础是_____________，关键步骤是____________________。

(3)利用转基因羊生产人凝血因子时，常用________技术将目的基因导入羊的____________，而后经过一段时间的体外培养再利用_________技术移入母体。若欲同时获得多头基因相同的转基因羊，可以采用___________技术。

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(10分)回答有关基因工程的问题：

(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生________末端，

也可能产生______末端。

(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因、启动子、________、

和________。其中启动子的作用是________识别和结合的部位，驱动基因转录。

（3）在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；（4）为了检测胰岛素基因是否导入受体细胞，检测方法是采用技术。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成胰岛素，常用________技术。

(5)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的　    　中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________ 上。

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在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：

（1）酶甲和酶乙作用的化学键是__________，胰岛素注射液需保存在低温处，其原理是__________。

（2）可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的__________序列，用该序列与质粒构建胰岛素原基因表达载体，此操作的目的是____________________。

（3）若受体细胞是细菌，需先用__________处理细胞，使其更易于吸收环境中的DNA分子，胰岛素原基因表达载体进入细菌，完成__________过程，再经过筛选及鉴定，即可建立能稳定合成__________的基因工程菌。

（4）用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从__________中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理可转变为胰岛素。

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基因表达载体的构建是基因工程的重要技术。下图甲表示以大肠杆菌为受体细胞的基因表达载体的构建过程，请回答以下问题：

（1）质粒中的复制原点是________________酶识别和结合的位点。

（2）体外重组的质粒可通过_______离子参与的________方法导入大肠杆菌细胞

（3）为了筛选获得含有上图所示重组质粒的大肠杆菌，实验人员首先将经转化处理过的大肠杆菌接种在含_____________（抗生素）的培养基中，并出现菌落（图乙），然后用灭菌后的丝绒包上棉花制成的一枚“印章”，将图乙所示培养基上的菌落印到含__________（抗生素）的另一培养基上，培养后形成菌落（图丙）。图丙中，________（填能正常生长繁殖或不能正常生长繁殖）的菌落已导入含目的基因的重组质粒。

（4）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体。而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。噬菌体载体与质粒载体相比，其优点是__________________________________ 。

（5）1967年，罗思和海林斯基发现细菌染色体DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞之间转移，这一发现对于当时基因工程技术的发展有什么促进作用？__________________________________

（6）若某DNA分子片段用两种限制酶酶切成不同长度的片段（结果如下表所示）。

7．5kb、2．9kb和6kb三个片段中不存在BamHI和BglII两种酶的酶切位点，请根据上述酶切结果说明判断依据：_______________。

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径柳匙叶草是一种泌盐植物。科研工作者将径柳匙叶草液泡膜Na＋/K＋逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到棉花细胞内，获得了转基因耐盐棉花新品种。图1是获取的含有目的基因的DNA片断，Sau3A I、EcoR I、BamH I为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图2是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图3是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请分析回答问题：

（1）若图1所示DNA片段是利用径柳匙叶草的DNA直接获得的，则该获取目的基因的方法为_________。

（2）不能在径柳匙叶草根尖分生区细胞中获得TaNHX2基因的mRNA，其原因是_________。

（3）若用BamH I切割图1所示的DNA片段，获得目的基因，则需选用_________切割图3所示质粒，以便构建基因表达载体，该方案的缺陷是_________。故切割图1所示DNA片段的最佳方案是选用_________酶。

（4）用上述最佳方案构建基因表达载体，所得重组质粒_________ （选填“能”“不能”或“不一定能”）被BamH Ⅰ切割。

（5）为了检测技术成果，科研工作者在个体水平的检测方法是_________。

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胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程（融合蛋白A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白）。请回答下列问题：

（1）图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是_____________________。

（2）图1中启动子是________酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是_________________________。

（3）构建基因表达载体时必需的工具酶有___________________。

（4）β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于_____________________________。

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