（10分）为了提高乙肝疫苗的预防效果，科学家们对于该疫苗的研发过程做如下改进：提取乙肝病毒...

（10分）为了提高乙肝疫苗的预防效果，科学家们对于该疫苗的研发过程做如下改进：提取乙肝病毒（HBV）基因重组后，与β-半乳糖苷酶基因结合，形成重组质粒BPT（如图1），随后的操作如图2，请回答下列问题：

（1）在图一中_____（A/B）插入终止子。构建重组质粒BPT必须使用__________作为工具酶。

（2）从大肠杆菌中提取融合蛋白P-BPT仍需进一步修饰、纯化。其主要原因是因为大肠杆菌不具备__________（细胞器）。

（3）实验中抽取小鼠脾的淋巴细胞进行细胞培养，在培养基中需要添加_______防止杂菌生长。从分子水平上使用__________对特异性免疫应答结果进行检测。

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我国科学家通过基因工程生产出了乙型肝炎病毒疫苗为预防乙肝提供了有力的保障。通过基因工程生产乙肝疫苗的过程如下图所示。请回答下列问题：

乙肝病毒有关基因细菌大量生产疫苗

（1）若要获得大量的目的基因，可采用PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有_________种，所需的酶是___________。

（2）进行②过程之前需构建基因表达载体，其中常用的载体是___________。为提高②过程的转化效率常采用的方法是______________________。

（3）若将上述受体菌换成酵母菌，生产乙肝疫苗的效果会更好，从细胞结构的角度分析，原因是______________________。

（4）乙肝病毒可以用于基因工程中可推知乙肝病毒属于___________（填“DNA”或“RNA”）病毒。乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是______________________。

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转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如下图所示(①至④代表过程，A至C代表结构或细胞)：

(1)在图中①基因表达载体的构建过程中，为了使目的基因正常表达，目的基因的首端必须有___________识别和结合的部位。将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及的方法是__________，之所以要把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，这是利用T-DNA_______________的特点。

(2)过程②的具体操作是：先用Ca2+处理农杆菌，使其成为____________细胞；再将含乙肝病毒表面抗原基因的重组Ti质粒溶于缓冲液中与经处理的农杆菌混合，完成转化过程。乙肝病毒表面抗原的基因能否在　 草莓植株体内维持稳定遗传的关键____________，通常采用____________的方法进行检测。

(3)基因工程中，若要培育乳腺生物反应器，应选用动物的__________细胞为受体细胞，且该受体的细胞的性染色体组成应为_________型。

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美国科学家从乙肝病毒中提取出相关抗原基因，并将其植入土豆，从而培育出了含乙肝疫苗的转基因土豆， 主要操作过程如下图所示（图中限制酶识别的DNA序列均不相同）。请回答下列问题：

（1）在获取抗原基因和切割质粒时，应选用的限制酶是________________________。

（2）在操作Ⅰ中会不会发生抗原基因或质粒的自我环化？________。理由是_。

（3）操作Ⅲ是对受体细胞进行筛选的过程，在所用培养基中需添加适量的卡那霉素，原因是__。

（4）操作Ⅳ采用的是____________技术，该过程所用培养基中必须添加的植物激素是_。

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人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。下图为“转基因酵母乙肝疫苗”的生产过程示意图，该过程所用酵母菌为毕赤酵母菌，其体内无天然质粒，科学家改造出了下图所示的pPIC9K质粒（松弛控制型，复制不受宿主细胞控制）用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合与染色体组已实现表达。请回答下列问题：

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上限制酶_________的识别序列，这样设计的优点是可避免质粒和目的基因的自身环化。步骤1应选用___________（填“E•coli”或“T4”）DNA连接酶。

（2）步骤2的目的是______________________。已知大肠杆菌每20分钟分裂一次，若1个大肠杆菌中导入了 10个重组质粒，则1小时后可从1个大肠杆菌的后代中得到重组质粒的个数___________。

（3）步骤4中应选用限制酶___________切割重组质粒以获得一段线性DNA，然后将其导入毕赤酵母菌细胞。为了确认毕赤酵母菌转化是否成功，应在培养基中加入___________以便筛选。除此以外，还可以用分子杂交技术鉴定上图中的毕赤酵母菌转化是否成功，过程如下图所示:

根据图中显示结果推算，若要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落，则上图中的酵母菌菌落数至少要为___________个。

（4）已知质粒在细胞传代过程中有丢失现象，试分析毕赤酵母表达系统的遗传稳定性高于大肠杆菌表达系统的主要原因_________________________________。

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编码乙肝病毒（HBV）表面S蛋白的基因疫苗，被小白鼠骨骼肌细胞吸收后可表达出S蛋白。S蛋白（抗原）引发系列的体液免疫和细胞免疫。图中数字代表细胞，字母代表生理过程，细胞⑦可诱导靶细胞裂【解析】
图乙中抗体效果价用衡量免疫效果的数量单位表示。有关分析错误的是

A.图甲中细胞①和⑤军事T细胞，细胞⑦是效应T细胞

B.树突状细胞的功能是识别和处理抗原，呈递抗原S蛋白

C.经图甲中N过程形成的细胞③与细胞⑦细胞膜上均缺少抗原S蛋白的受体

D.图乙是用50µg空基因疫苗作对照组，两周后抽取小鼠血清检测抗体含量得到的

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编码乙肝病毒（HBV）表面S蛋白的基因疫苗，被小鼠骨骼肌细胞吸收后可表达出S蛋白。S蛋白（抗原）引发系列的体液免疫和细胞免疫。图甲中数字代表细胞，字母代表生理过程，细胞⑦可诱导靶细胞裂解；图乙中抗体效价用衡量免疫效果的数量单位表示。有关分析错误的是

A．图甲中细胞①和⑤均是T细胞，细胞⑦是效应T细胞

B．树突状细胞的功能是识别和处理抗原，呈递抗原S蛋白

C．经图甲中N过程形成的细胞③与细胞⑦细胞膜上均缺少抗原S蛋白的受体

D．图乙是用50μg空基因载体作对照组，两周后抽取小鼠血清检测抗体含量得到的

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编码乙肝病毒（HBV）表面S蛋白的基因疫苗，被小鼠骨骼肌细胞吸收后可表达出S蛋白。S蛋白（抗原）引发系列的体液免疫和细胞免疫。图甲中数字代表细胞，字母代表生理过程，细胞⑦可诱导靶细胞裂解；图乙中抗体效价用衡量免疫效果的数量单位表示。有关分析错误的是(　 )

A．图甲中细胞①和⑤均是T细胞，细胞⑦是效应T细胞

B．树突状细胞的功能是识别和处理抗原，呈递抗原S蛋白

C．经图甲中N过程形成的细胞③与细胞⑦细胞膜上均缺少抗原S蛋白的受体

D．图乙是用50μg空基因载体作对照组，两周后抽取小鼠血清检测抗体含量得到的

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回答有关现代生物技术的问题

乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种慢性传染病，主要采用基因工程乙肝疫苗进行防治。科研人员采用转基因技术将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因片段导入酵母细胞或中国仓鼠卵巢细胞（CHO），让重组后的酵母或CHO细胞在体外培养过程中产生HBsAg，将其分离、提纯之后制成乙肝疫苗，部分生产过程如图。

（1）下列①～④表示获得重组CHO细胞的步骤，其中步骤④是______；①-④步骤的正确排序是______。

①重组DNA分子导入CHO细胞

②筛选成功导入HBsAg基因的CHO细胞

③人工合成HBsAg基因

④______

（2）大量培养重组酵母和重组CHO细胞生产乙肝疫苗过程中，需将培养液中HBsAg与其他杂质分离，可采用的方法是______（多选）。

A．破碎细胞 B．加入硫酸铵 C．改变pH D．冷冻干燥

（3）利用重组酵母和重组CHO细胞生产乙肝疫苗，分别属于生物工程中的______、______领域。

（4）利用重组CHO细胞和重组酵母生产基因工程乙肝疫苗，目前都在进行规模化生产，但两种方法各有不足和优势。请在下列选项中选择合适的编号填入表对应的空格中，以表示你对此问题的分析（编号可重复选用）：

①结构简单、遗传操作较为容易

②表达的HBsAg更接近天然形式，疫苗稳定性好

③表达的HBsAg与天然形式存在差异

④培养条件要求高，生产成本较高

⑤可将HBsAg分泌到胞外，易于分离提纯

⑥易于培养、繁殖迅速，生产成本较低

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现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。现在乙型肝炎疫苗的研制已经到了基因工程疫苗阶段。

图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程，将乙肝病毒表面蛋白(HBsAg)基因片段导入大肠杆菌，让重组后的大肠杆菌在培养过程中产生HBsAg。其中选用的质粒lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。

1.下列①～④表示基因工程疫苗研制的步骤，其中步骤①是___________；①-④步骤的正确排序是________________。

①　　　 ？　　　　　 　　　　 ②重组DNA分子导入大肠杆菌　　

③获取HBsAg基因　　　　 ④HBsAg基因与运载体的连接

2.据图可知获取HBsAg基因选用的限制酶方案是　　　　　 。

A.EcoRV和BamHI B.只用EcoRV C.只用EcoRI D.只用BamHI

3.图中所示抗原蛋白HBsAg和相应抗体的基因表达过程中，不同的是　　　　　　　　 。

A.基因所来源的物种 B.转录出的mRNA碱基序列

C.氨基酸对应遗传密码子表 D.翻译出的氨基酸序列

4.为了获得产生HBsAg的大肠杆菌，培养一段时间挑选出_____（蓝色/白色）的菌落进一步培养，分子HBsAg属于免疫反应中的_____________。

5.接种基因工程疫苗比接种灭活获减毒的病毒疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因：___________________________________________________。

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