（11分）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒...

（11分）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________。观察上图，如果A为质粒，则C表示________。

(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

_______________________________________________________________________

(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是_______________________________________________________________________

(4) 作为受体大肠杆菌应不含_______________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_______，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。

（5）基因工程中使用的限制酶，其特点是_______________________，下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。

将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有＿＿＿。（可多选）A．X－1  B．X－2   C．X－3   D．X－4

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目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________。

（2）pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—G↓AATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

（3）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功地获得了重组质粒。说明____________。

（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是____________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________________。

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目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________。

(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功地获得了重组质粒。说明____________________________________________________。

(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是____________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________________。

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（10分）人工构建的大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中应用最广泛的载体（见图1）。除标注外，图中其他英文缩写表示该质粒上不同的限制性核酸内切酶的切割位点。请分析回答：

（1）此质粒的化学本质是________，它可以作为多种目的基因的（运）载体，原因是________。amp^r和tet^r在基因工程中的主要作用是。

（2）人胰岛素由两条肽链共有51个氨基酸组成，如图2所示。

①通过基因工程培育能合成人胰岛素的工程菌时，可先依据________推出

________序列，再推出________序列，然后用化学方法人工合成A链和B链基因的片段。将此基因片段分别与________重组后，再导入大肠杆菌内。

② 在大肠杆菌内合成的单独的A、B两条多肽链没有生物活性，是因为细菌中缺少________，不能。若要直接获得有活性的转基因人胰岛素，可以选择________作为受体细胞。

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人工构建的大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中应用最广泛的载体(见图1)。除标注外，图中其他英文缩写表示该质粒上不同的限制性核酸内切酶的切割位点。请分析回答问题：

(1)此质粒的化学本质是___________，它可以作为多种目的基因的(运)载体，原因是　　　　　　　　　　　 。ampr和tetr在基因工程中的主要作用是________________________________________________________________________。

(2)人胰岛素由两条肽链共有51个氨基酸组成，如图2所示。

①通过基因工程培育能合成人胰岛素的工程菌时，可先依据________推出________序列，再推出________序列，然后用化学方法人工合成A链和B链基因的片段。将此基因片段分别与________重组后，再导入大肠杆菌内。

②在大肠杆菌内合成的单独的A、B两条多肽链没有生物活性，是因为细菌中缺少________，不能________。若要直接获得有活性的转基因人胰岛素，可以选择________________作为受体细胞。

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下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。图a是基因工程中经常选用的载体-pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因．目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性．为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）．再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）．据此分析并回答：

（1）pBR322质粒的基本组成单位是　　　　　　 。在基因工程中，质粒上的Amrr、Tetr称为　　　　 基因。

（2）与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是　　　　　　　　　　　　　　 ，由此说明　　　　　　　　　　　　　　　　　 。

（3）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的　　　　　　　　　 步骤，该基因工程中的受体细胞是　　　　　　 。

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我国基因工程药物的研制和生产发展迅猛，下图是利用基因工程方法生产重组人生长激素的示意图。图中质粒表示基因工程中经常选用的载体—pBR322质粒，Ampr表示青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。根据上图回答下列问题（限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ切割形成的末端均不相同）：

（1）过程②必需的酶是　　 ，过程④必需的酶是　　　 。⑤过程中为提高成功率，常用　　　　　　　　 溶液处理大肠杆菌。

（2）如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对质粒pBR322进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时，则形成的DNA片段共　　　　 种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段的比例是　　　　 。

（3）如果只用限制酶PstI切割目的基因和质粒pBR322，完成过程④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌（不含Ampr、Tetr抗性质粒）先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。接种到甲培养基上的目的是筛选　　　 的大肠杆菌，含有目的基因的大肠杆菌在乙、丙培养基上的存活状态分别是　　　　 ，　　　 。

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我国基因工程药物的研制和生产发展迅猛，下图是利用基因工程方法生产重组人生长激素的示意图。图中质粒表示基因工程中经常选用的载体—pBR322质粒，Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^r表示四环素抗性基因。根据下图回答下列问题（限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ切割形成的末端均不相同）：

（1）过程②必需的酶是________，过程④必需的酶是________。⑤过程中为提高成功率，常用________溶液处理大肠杆菌。

（2）如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对质粒pBR322进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时，则形成的DNA片段共________种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段的比例是________。

（3）如果只用限制酶PstI切割目的基因和质粒pBR322，完成过程④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌（不含Amp^r、Tet^r抗性质粒）先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。接种到甲培养基上的目的是筛选________的大肠杆菌，含有目的基因的大肠杆菌在乙、丙培养基上的存活状态分别是________，________。

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下图a示基因工程中经常选用的载体—pBR322质粒，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，Tet^r表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Amp^r和Tet^r的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。据此分析并回答：

（1）pBR322质粒的基本组成单位是________ 。该基因工程中，质粒上的Amr^r、Tet^r称为________基因。

（2）与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是________，由此说明目的基因插入了________中。

（3）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中

的步骤。该基因工程中的受体细胞是________ 。

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（6分）下图a示基因工程中经常选用的载体－pBR322质粒，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，Tet^r表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Amp^r和Tet^r的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。据此分析并回答：

（1）pBR322质粒的基本组成单位是________。在基因工程中，质粒上的Amr^r、Tet^r称为________基因。

（2）与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是________，由此说明________。

（3）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的________步骤，该基因工程中的受体细胞是。

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