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抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小分子肽，具有广谱抗菌活性，对病毒和癌细胞都有一定的杀伤力，科研人员将抗菌肽基因导入大肠杆菌细胞内获得了能高效表达抗菌肽的工程菌。请回答下列问题。
（1）利用PCR技术扩增抗菌肽基因时，设计的引物之间不能________，以避免引物自连。反应体系中，使模板DNA解旋的操作方法是________，加入的Taq酶所起的作用是________。
（2）大肠杆菌含有许多蛋白酶，在制备抗菌肽目的基因表达载体时宜选用分泌型载体。分泌型载体能将抗菌肽在信号序列的指引下运出细胞外，使用分泌型载体的突出优点是________。将基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用________处理大肠杆菌制备________细胞。
（3）抗菌肽本身对大肠杆菌具有一定的杀伤性，对抗菌肽的分子构造进行改造，可得到对大肠杆菌杀伤性小的抗菌肽，该改造技术直接改造的对象是________。
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鸡干抗素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①-④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_____________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了______________和_____________序列，以便于后续的剪切和连接。
(2)步骤②所构建的基因表达载体中末标注出的必需元件还有_______________________，步骤③中需先用__________________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再通过PCR扩增制备探针，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是_________________________。
(4)用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数(植物受病毒侵染的严重程度)为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79，说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有_______________________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了________和________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有________个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列_______(相同/不相同)
(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，步骤③中需先用________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
（1）表格中的限制酶EcoRⅠ切割DNA分子后形成的黏性末端是_________________。
（2）步骤①是利用PCR技术扩增鸡干扰素基因，进行PCR的前提是___________。
（3）图中选用两种限制酶分别处理鸡干扰素基因和农杆菌Ti质粒，这样做的优点有_________。
（4）步骤②所构建的基因表达载体中启动子的作用是 ____________。
（5）步骤③中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
（6）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再通过PCR扩增制备探针，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是__________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和__________序列，以便于后续的剪切和连接，一个DNA分子三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有__________个。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是__________。
A. Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
B. 目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
C. 酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同
D. 酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有__________，步骤③中需先用__________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过__________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了________和________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有________个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列_______(相同/不相同)
(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，步骤③中需先用________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是____。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和___________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是_________。
A．Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同
D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有___________，步骤③中需先用______处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是___________。
（4）用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数（植物受病毒侵染的严重程度）为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79。说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有__________。
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乳铁蛋白是一种糖蛋白，其具有广谱抗菌、抗病毒感染的作用。科研人员将人乳铁蛋白基因通过载体转入山羊ES细胞，最终成功培育出能产生人乳铁蛋白的转基因山羊。回答下列问题：
（1）利用PCR技术从cDNA文库中获取乳铁蛋白基因（基因序列未知），需根据乳铁蛋白氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是__________________。在PCR体系中需加入其中的_________（填“全部”、“任意1种”或“其中2种”）引物。
（2）山羊ES细胞可从囊胚的____________分离获得。从功能上看，该细胞具有____________。
（3）将人乳铁蛋白基因导入山羊ES细胞常用____________法。转化成功的ES细胞，体外培养过程中，通入CO2气体的目的是________________________。
（4）经鉴定，某转基因山羊产生的配子中有一半带有外源基因，请写出利用该山羊培育纯合转基因山羊的思路______________________________________________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草愈伤组织细胞中，经组织培养，以获得抗病毒烟草。请回答下列问题：
（1）若要体外大量合成鸡干扰素基因，可采用_______技术，该技术所使用的引物实质是_____________。
（2）构建一个完整的重组基因表达载体应该包括复制原点、启动子、目的基因、标记基因和终止子，其中启动子的作用是_______________________________________________。
（3）将重组表达载体导入农杆菌之前，需用Ca2+处理农杆菌，使其成为_________，以便提高转化率；重组基因表达载体导入烟草愈伤组织细胞后，该细胞主要经过_____________、___________两个阶段发育成抗病毒烟草。
（4）鸡干扰素能在烟草细胞中表达的原因是_______________________________；若要从个体水平上检测抗病毒烟草是否培育成功，可采用的方法是____________。
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抗菌肽具有热稳定性以及广谱抗细菌等特点，其广泛的生物学活性显示了在医学上良好的应用前景。科研工作者将若干编码抗菌肽（ABP）序列按照首尾相连的方式插在质粒PLG339的布康唑抗性基因内部，形成长度为4 800bp（1bp为一个碱基对）的重组质粒PLG339-nABP，相关过程如图所示。已知重组质粒中，每个编码ABP序列中都含有限制酶AccⅢ的一个切点，基因trpA的表达产物可使细胞利用无机氮源合成色氨酸（色氨酸是微生物生长必须的氨基酸）。请据图回答下列问题：
（1）质粒PLG339的基本单位是______。
（2）若PLG339-nABP经限制酶AccⅢ处理后，产生66bp和4140bp两种长度的DNA片段，单个抗菌肽（ABP）最多由______个氨基酸构成（不考虑终止密码）。
（3）现有大肠杆菌和酵母菌两种菌群，可作为导入PLG339-nABP的受体细胞是______，理由是______。
（4）若选定的受体细胞为trpA基因缺陷型，则需采用两步法筛选含重组质粒的细胞。第一步筛选的固体培养基在营养成分上的要求是：______，不含色氨酸；第二步采用“影印法”，将第一步所得菌落转移到新的培养基上进行培养，该培养基中应添加______。通过对照，最终选出能在第一步培养基上生长，而不能在第二步培养基上生长的菌落即为符合要求的成功导入重组质粒的细胞。
（5）在测试转基因表达产物ABP对金黄色葡萄球菌的杀菌效果时获得了如图所示的结果，据此可获得的结论是：ABP抑菌效果与ABP的______和金黄色葡萄球菌的______有关。
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