如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图1中Ap为氨苄青霉素抗...

如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。图中EcoR Ⅰ、Pvu Ⅰ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。回答下列问题。

(1) 图中三种质粒中不能作为目的基因运载体的是________，理由是________、________。

(2) 在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用________酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.1kb和5.6 kb，或者________kb和________kb的片段，则可判断该重组质粒已与目的基因重组成功。

(3) 为研究目的基因D的功能，研究人员用下图所示的引物组合分别扩增D基因的D1片段、D3片段(DNA复制子链的延伸方向5′→3′)。

注：引物Ⅱ、Ⅲ上的x，y片段分别与N基因两端互补配对

用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增后，得到的绝大部分DNA片段是下图中的________。

ab cd

②将大量N基因片段与扩增得到的D1片段、D3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是________(填“D1－N”或“D1－D3一N”或“D3－N”或“D1－N—D3”)。

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如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图1中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。图中EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。回答下列问题：

（1）图中三种质粒中不能作为目的基因运载体的是______，理由是______、______。

（2）在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用______酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.1kb和5.6kb，或者______kb和______kb的片段，则可判断该重组质粒已与目的基因重组成功。

（3）为研究目的基因D的功能，研究人员用图2所示的引物组合分别扩增D基因的D1片段、D3片段（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）。

注：引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段分别与N基因两端互补配对

①用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增后，得到的绝大部分DNA片段是图3中的______。

②将大量N基因片段与扩增得到的D1片段、D3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是______（填“D1-N”或“D1-D3-N”或“D3-N”或“D1-N-D3”）。

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如图为三种质粒和一个含目的基因的DNA片段，其中ApR为氨苄青霉素抗性基因，TcR为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等为限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点的距离。已知1 kb＝1 000个碱基对，请回答下列问题：

(1)片段D为目的基因中的某一片段，则下列酶能形成或断裂图中②所示化学键的有_________(多选填字母)。

a、限制性核酸内切酶　　 b、DNA连接酶 c、Taq酶  d、解旋酶　　　　 e、DNA水解酶

(2)若想获得大量的目的基因，可采用________法进行扩增，含目的基因的DNA片段共经过______次循环后刚好能形成等长的目的基因片段，复制n次需要提供特异性引物对______对。

(3)图中作为目的基因运载体最理想的质粒是________(填“A”“B”或“C”)，请据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是________________________________

(4)用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和质粒B形成的重组质粒，并进行电泳观察，可出现长度分别为1.1 kb和______kb的两个片段，或者长度分别为_________的两个片段(重组质粒上目的基因的插入位点与EcoR I的识别位点之间的碱基对忽略不计)。

(5)将分别用限制酶Pvu Ⅰ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作，则受体细胞的类型（对抗生素表现出抗性R或敏感性S，蓝白代表菌落颜色）包含________(多选填字母)。

A．ApR、蓝色　　B．ApR、白色　　　 C．ApS、蓝色　　 　　 D．ApS、白色

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图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：

（1）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。

（2）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________、________________________。

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下图为三种质粒和一个含目的基因的 DNA 片段，其中 Ap 为氨苄青霉素抗性基因，Tc 为四环素抗性基因，lacZ 为蓝色显色基因，EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。已知1 kb＝1000个碱基对的长度。请回答下列问题：

（1）片段 D 为目的基因中的某一片段，则限制酶和 DNA 连接酶的作用部位依次是_______________ 、______________（填图中数字标号））

（2）图中能作为目的基因运载体最理想的质粒是__________（填A/B/C））据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是______________、_________。

（3）如果将目的基因和质粒 A 构建重组质粒,然后再用 EcoRⅠ酶切这个重组质粒，进行电泳观察，可出现长度分别为 1.1 kb 和_________________kb 的两个片段，或者长度分别为___________kb 、_________kb的两个片段。

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下图为三种质粒和一个含目的基因的 DNA 片段，其中 Ap 为氨苄青霉素抗性基因，Tc 为四环素抗性基因，lacZ 为蓝色显色基因，EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。已知1 kb＝1000个碱基对的长度。请回答下列问题：

（1）片段 D 为目的基因中的某一片段，则限制酶和 DNA 连接酶的作用部位依次是_______________ 、______________（填图中数字标号））

（2）图中能作为目的基因运载体最理想的质粒是__________（填A/B/C））据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是______________、_________。

（3）如果将目的基因和质粒 A 构建重组质粒,然后再用 EcoRⅠ酶切这个重组质粒，进行电泳观察，可出现长度分别为 1.1 kb 和_________________kb 的两个片段，或者长度分别为___________kb 、_________kb的两个片段。

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（四）生物工程

图1是科学家用转基因（大鼠生长激素基因）方法培育“巨型小鼠”过程中的一个步骤。图2为3种质粒和1个含目的基因的DNA片段，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，都可以作为标记基因。复制原点是质粒上必需的一段复制起始的序列，与重组质粒的自主复制有关。

1.图1表示基因工程中的________（步骤），该步骤采用的技术方法是________。

2.据图2，为构建重组质粒，应使用限制酶________（Pvu Ⅰ / EcoR Ⅰ）进行切割。其中，质粒A、质粒C不能作为此目的基因运载体的原因是________。

3.在分离提纯限制酶EcoR Ⅰ的过程中，能使EcoR Ⅰ沉淀的方法是________。

A. 溶菌酶等酶解细菌细胞壁

B. 超声波、压力等

C. 改变pH或加入硫酸铵

D. 添加稳定剂和填充剂

4.研究人员用交联法固定化EcoR Ⅰ，用戊二醛作为交联剂，使酶交联在一起，限制酶的移动，如图3所示。但发现固定化后的EcoR Ⅰ的活性比未固定化的要低，其最可能的原因是戊二醛________。

A. 增加了酶的分子量

B. 改变了部分酶的活性部位的空间结构

C. 占据了酶的活性部位

D. 分解了部分的酶

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如图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图．图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等为限制酶及其切割的位点与复制原点的距离，1Kb=1000个碱基对长度．请据图回答：

（1）质粒A、C不能作为目的基因运载体的理由分别是____________________，__________________。

（2）将图中的目的基因与质粒B进行重组，需要用到_____________________________酶．如果是两两重组，可能有_________________种长度的重组结果。

（3）基因工程中检测筛选含有目的基因的重组质粒是一个重要的步骤。现运用_____________酶切质粒，完全酶切后进行电泳观察，若出现长度为1.1kb和____________kb，或者___________kb和__________kb的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRⅠ的识别位点之间的碱基对忽略不计）。

（4）基因治疗包括___________________和_________________。

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下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lcZ为蓝色显色基因，lacZ正常表达菌落呈蓝色。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点的距离，单位为kb(1kb=1000个碱基对)。回答下列问题：

（1）用图中的目的基因与质粒构建基因表达载体时，应该选择质粒________(填“质粒A”“质粒B”或者“质粒C”)，选择的限制酶是___________。

（2）转录的起始部位称为____________，是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶______________________的部位。

（3）如果选择的质粒与目的基因重组成功，并且在受体细胞中能正常表达，则所形成的重组质粒用EcoRⅠ完全酶切，并进行电泳观察，可出现的片段长度有_____________或____________。

（4）导入大肠杆菌后，为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，在普通琼脂培养基中还需加入_________，形成的菌落颜色为_____________。

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（8分）下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoR Ⅰ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8 Kb）等为限制酶及其切割的位点与复制原点的距离，1Kb=1000个碱基对长度。请据图回答：

（1）质粒A、C不能作为目的基因运载体的理由分别是 　 　　 、 　 　　 。

（2）将图中的目的基因与质粒B进行重组，需要用到 　 　　 酶。如果是两两重组，可能有 　 　　 种长度的重组结果，。

（3）基因工程中检测筛选含有目的基因的重组质粒是一个重要的步骤。现运用 　 　　 酶切质粒，完全酶切后进行电泳观察，若出现长度为1.1kb和 　 　　 kb，或者 　 　　 kb和 　 　　 kb的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRⅠ的识别位点之间的碱基对忽略不计）。

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