图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体 质粒 P0 具有四环素 抗性基因（t...

图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。

（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。

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图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体 质粒 P0 具有四环素 抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoR　 V 酶切位点为，EcoR　 V 酶切出来的线性载体 P1 为__________未端。

（2）用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺 嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________ 的 脱氧核苷酸，形成 P2；P2 和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质 粒 P3。

（3）为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表 中结果判断，应选择的菌落是_____（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、___________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙、丙 3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是____________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一 菌落的质粒中扩增出了 400　 bp 片段，原因是_______________。

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图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：

（1）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。

（2）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________、________________________。

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下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答：

（1）EcoR V酶切P0形成的末端为______末端。

（2）通过PCR扩增获得的目的基因，其两端各自带有一个鸟嘌呤脱氧核苷酸。为了能使载体P1能与目的基因连接，可以用______酶处理，在两端各添加了一个碱基为______的脱氧核苷酸，形成P2。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的培养基进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。结果表明，菌落______是符合要求的。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确的重组质粒中的相应位置。

①引物中A＋T比例越高，PCR过程中退火温度越______。PCR中提供的酶是______。

②某学生用一对引物甲和乙从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，原因是______。PCR过程中需要提供引物的原因是______。

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下图表示基因工程中构建生产人乳铁蛋白的重组载体。图中tetR表示四环素抗性基因,ampR表示氨苄青霉素抗性基因,BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。图中将人乳铁蛋白基因插入载体,需用几种限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因?筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含哪种抗生素的培养基上进行?(　　)

A. 1种　四环素

B. 2种　氨苄青霉素

C. 1种　氨苄青霉素

D. 2种　四环素

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下图表示基因工程中构建生产人乳铁蛋白的重组载体。图中tetR表示四环素抗性基因,ampR表示氨苄青霉素抗性基因,BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。图中将人乳铁蛋白基因插入载体,需用几种限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因?筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含哪种抗生素的培养基上进行?(　　)

A. 1种　四环素

B. 2种　氨苄青霉素

C. 1种　氨苄青霉素

D. 2种　四环素

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Ⅰ．下图a表示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导人原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上。得到如图b的结果（黑点表示菌落）。再将灭菌的绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含圆环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。据此分析并网答下列问题：

（1）pBR322质粒的基本组成单位是_________。该基因工程中，质粒上的Ampr、Tetr称为____________基因。

（2）与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型可以推知，目的基因插入了_______中。

Ⅱ．下图是转基因大豆的培育过程，据图回答下列问题：

（3）重组质粒构建过程中，需要的酶有________________。

（4）据图可知，将目的基因导入大豆细胞的方法是_________。该法将外源基因插入到_________上，转入农杆菌，最终，插入到大豆细胞中染色体的DNA上。科学家通过PCR技术可获得大量该外源目的基因。该技术操作流程的三个重要步骤是_______________。

（5）可采用________技术，检测转基因大豆染色体的DNA上是否插入了图的基因；也可以采用____________的方法，检测目的基因是否翻译成蛋白质。

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pBR322是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称，图甲是pBR322结构示意图（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示几种限制酶识别序列及其切割位点。回答下列问题：

（1）质粒是基因工程中常用的工具，其作用是____________________。人工构建pBR322过程中需要的酶是__________________________________________________。

（2）为扩增目的基因可采用PCR技术，该技术利用了_________原理，该技术的前提是需要根据________合成引物。

（3）由图乙可知，经Sau3AⅠ酶切割得到的目的基因可以与被__________酶切割的pBR322连接成重组质粒，原因是____________________。将切割后的目的基因与pBR322质粒混合，加入相应酶反应后，用得到的混合物直接转化处于感受态的大肠杆菌，感受态是指____________________的生理状态。

（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，原因是____________________。

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pBR322是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称，图甲是pBR322结构示意图（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示几种限制酶识别序列及其切割位点。回答下列问题：

（1）质粒是基因工程中常用的工具，其作用是____________________。人工构建pBR322过程中需要的酶是__________________________________________________。

（2）为扩增目的基因可采用PCR技术，该技术利用了_________原理，该技术的前提是需要根据________合成引物。

（3）由图乙可知，经Sau3AⅠ酶切割得到的目的基因可以与被__________酶切割的pBR322连接成重组质粒，原因是____________________。将切割后的目的基因与pBR322质粒混合，加入相应酶反应后，用得到的混合物直接转化处于感受态的大肠杆菌，感受态是指____________________的生理状态。

（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，原因是____________________。

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某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的基因失活（Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用 BamHI 酶切后，与用 BamHI 酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_____（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，_________ 的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有______________的细胞也是不能区分的，其原因是________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_____的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于___________。

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