pBR322是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称...

pBR322是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称，图甲是pBR322结构示意图（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示几种限制酶识别序列及其切割位点。回答下列问题：

（1）质粒是基因工程中常用的工具，其作用是____________________。人工构建pBR322过程中需要的酶是__________________________________________________。

（2）为扩增目的基因可采用PCR技术，该技术利用了_________原理，该技术的前提是需要根据________合成引物。

（3）由图乙可知，经Sau3AⅠ酶切割得到的目的基因可以与被__________酶切割的pBR322连接成重组质粒，原因是____________________。将切割后的目的基因与pBR322质粒混合，加入相应酶反应后，用得到的混合物直接转化处于感受态的大肠杆菌，感受态是指____________________的生理状态。

（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，原因是____________________。

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pBR322是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称，图甲是pBR322结构示意图（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示几种限制酶识别序列及其切割位点。回答下列问题：

（1）质粒是基因工程中常用的工具，其作用是____________________。人工构建pBR322过程中需要的酶是__________________________________________________。

（2）为扩增目的基因可采用PCR技术，该技术利用了_________原理，该技术的前提是需要根据________合成引物。

（3）由图乙可知，经Sau3AⅠ酶切割得到的目的基因可以与被__________酶切割的pBR322连接成重组质粒，原因是____________________。将切割后的目的基因与pBR322质粒混合，加入相应酶反应后，用得到的混合物直接转化处于感受态的大肠杆菌，感受态是指____________________的生理状态。

（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，原因是____________________。

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目前所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图所示。

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于　　　　 　　　　　　 。

（2）pBR322分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，EcoR 1只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端　　　　　　　　　 。

（3）pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BgIⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复　　　　　　 键，即获得了重组质粒。

（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是　　　　　　 　　　　 ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是　　　　　　 　　　　 。

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目前所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图所示。

(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于。

(2)pBR322分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，EcoR 1只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端。

________

(3)pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BgIⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复___ ___ 键，成功的获得了重组质粒。

(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是________________ ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_____________。

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基因工程重要环节是构建基因表达载体。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列和切割位点，图2表示DNA片段，图3表示目的基因及限制酶切点，图4表示质粒。请回答下列问题：

（1）若图2就是图1中的最左边显示的三个碱基对，则④⑤⑥⑦⑧⑨对应的碱基依次是________。限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，切开的位置是图2中编号为______位置的________键。

（2）已知DNA复制子链的延伸方向是5′→3′，图3中的A、B、C、D在不同情况下可以作为引物，在PCR技术中，扩增此目的基因，应该选用________两个作为引物。该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生目的基因片段__________个。

（3）图4中，如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对此质粒进行三种方法切割。第一种方法用其中一种酶、第二种方法用其中两种酶、第三种方法用其中三种酶分别切割，依次产生_______、_______、_____三种片段。

（4）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用____________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过______________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入经____________处理过的_____________态的大肠杆菌中。

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下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素（由人垂体细胞产生的一种蛋白质类激素）的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶pstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的黏性末端各不相同，而Ampr表示青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请据图回答以下相关问题：

（1）过程①所用细胞是________________，过程②所用的酶是_________。

（2）人生长激素基因在经③处理之前需经过PCR扩增，扩增时应在PCR扩增仪中加入________酶用以催化互补链的合成。

（3）过程④所用的酶是___________________________。

（4）若用限制酶PstⅠ切割，完成过程④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，再将甲培养基上的单个大肠杆菌接种到丙培养基上，待形成12个菌落后，将相应菌落的一部分转接到乙培养基的相同位置上。一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到培养基乙上能存活的是导入含__质粒的大肠杆菌。生产人生长激素的工程菌应从丙培养基的菌落中选取，选取的依据是______。

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下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素（由人垂体细胞产生的一种蛋白质类激素）的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶pstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的黏性末端各不相同，而Ampr表示青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请据图回答以下相关问题：

（1）过程①所用细胞是________________，过程②所用的酶是_________。

（2）人生长激素基因在经③处理之前需经过PCR扩增，扩增时应在PCR扩增仪中加入________酶用以催化互补链的合成。

（3）过程④所用的酶是___________________________。

（4）若用限制酶PstⅠ切割，完成过程④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，再将甲培养基上的单个大肠杆菌接种到丙培养基上，待形成12个菌落后，将相应菌落的一部分转接到乙培养基的相同位置上。一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到培养基乙上能存活的是导入含__质粒的大肠杆菌。生产人生长激素的工程菌应从丙培养基的菌落中选取，选取的依据是______。

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基因工程中，需使用特定的酶处理目的基因和质粒，以便构建表达载体。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—^↓GATC—。下列操作正确的是

A．该质粒分子由四种碱基组成

B．构建该表达载体的工具酶是限制酶和耐高温DNA聚合酶

C．本实验应采用GeneⅡ作为载体的标记基因

D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

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下图为质粒限制酶酶切图谱，β-葡萄糖苷酶基因（bglB）不含图中所示的限制酶识别序列。研究人员在构建bglB基因表达载体时，应先选择限制酶，然后在扩增的bglB基因两端分别引入相应限制酶的识别序列，才能完成质粒和目的基因的重组。以下关于选择限制酶的说法，错误的是

注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同

A．选用限制酶Ndel或BamHI都能够获得所需的重组质粒

B．选用限制酶Xbal获得的重组质粒不能表达出β-葡萄糖苷酶

C．选用限制酶Pstl不能将bglB基因导入受体细胞

D．同时选用限制酶NdeI和BamHI，可避免目的基因与质粒反向连接

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下图为质粒限制酶酶切图谱，β-葡萄糖苷酶基因（bglB）不含图中所示的限制酶识别序列。研究人员在构建bglB基因表达载体时，应先选择限制酶，然后在扩增的bglB基因两端分别引入相应限制酶的识别序列，才能完成质粒和目的基因的重组。以下关于选择限制酶的说法，错误的是

注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同

A. 选用限制酶Ndel或BamHI都能够获得所需的重组质粒

B. 选用限制酶Xbal获得的重组质粒不能表达出β-葡萄糖苷酶

C. 选用限制酶Pstl不能将bglB基因导入受体细胞

D. 同时选用限制酶NdeI和BamHI，可避免目的基因与质粒反向连接

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