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转基因重组酵母乙肝疫苗是一种乙肝表面抗原（HbsAg)亚单位疫苗，它采用转基因的方法将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，转入啤酒酵母菌中，通过培养这种重组酵母菌来表达乙肝表面抗原亚单位。转基因酵母的产生过程如图所示。质粒上有SnaBⅠ、AvrⅡ、SacⅠ、BglⅡ四种限制性酶切割位点,且酶切序列如表所示。请回答：
(1)由于HBsAg基因序列已知，因此过程①可通过___________得到大量HBsAg基因，此外也可将其连接在________上，通过大肠杆菌培养扩增。
(2)构建含抗病基因的重组质粒时，应选用限制性核酸内切酶__________(不定项选择）（A.SnaBⅠ B.AvrⅡ C.SacⅠ D.BglⅡ)对含HBsAg基因的DNA和质粒进行切割，切割一个含HBsAg基因的DNA分子需要消耗
_______个水分子。
(3)不同的微生物通常需要不同的培养基进行培养，已知酿酒酵母培养基配方为:酵母提取物10g，蛋白胨20g,葡萄糖20g,定容至1L，加入1.5%琼脂粉制成固体培养基。则其灭菌条件应为（______）
A.高压蒸汽灭菌法，且温度为121℃,压力为1kg/cm2,灭菌15分钟
B.高压蒸汽灭菌法，且温度为95℃,压力为500g/cm2，灭菌30分钟
C.将配好的培养基放在超净台中，打开紫外灯和过滤风，灭菌30分钟
D.在超净台中,打开过滤风，在酒精灯火焰旁用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌
(4)将重组质粒导入酵母菌后，可用________法接种到固体培养基上。某同学在接种后得到如图所示的菌落分布，推测该同学接种时可能的操作失误是__________。若欲利用含卡那霉素的培养基筛选已导入HBsAg基因的酵母菌,则应使重组质粒中含有_______作为标记基因，这种培养基属于__________培养基。
(5)已知酵母菌的最适培养温度是28℃，在培养时可将培养皿倒置并放入__________进行培养。若不倒置培养将导致______________________。
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回答有关现代生物技术的问题
乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种慢性传染病，主要采用基因工程乙肝疫苗进行防治。科研人员采用转基因技术将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因片段导入酵母细胞或中国仓鼠卵巢细胞（CHO），让重组后的酵母或CHO细胞在体外培养过程中产生HBsAg，将其分离、提纯之后制成乙肝疫苗，部分生产过程如图。
（1）下列①～④表示获得重组CHO细胞的步骤，其中步骤④是______；①-④步骤的正确排序是______。
①重组DNA分子导入CHO细胞
②筛选成功导入HBsAg基因的CHO细胞
③人工合成HBsAg基因
④______
（2）大量培养重组酵母和重组CHO细胞生产乙肝疫苗过程中，需将培养液中HBsAg与其他杂质分离，可采用的方法是______（多选）。
A．破碎细胞 B．加入硫酸铵 C．改变pH D．冷冻干燥
（3）利用重组酵母和重组CHO细胞生产乙肝疫苗，分别属于生物工程中的______、______领域。
（4）利用重组CHO细胞和重组酵母生产基因工程乙肝疫苗，目前都在进行规模化生产，但两种方法各有不足和优势。请在下列选项中选择合适的编号填入表对应的空格中，以表示你对此问题的分析（编号可重复选用）：
①结构简单、遗传操作较为容易
②表达的HBsAg更接近天然形式，疫苗稳定性好
③表达的HBsAg与天然形式存在差异
④培养条件要求高，生产成本较高
⑤可将HBsAg分泌到胞外，易于分离提纯
⑥易于培养、繁殖迅速，生产成本较低
| 利用重组酵母细胞 生产乙肝疫苗 | 利用重组CHO细胞 生产乙肝疫苗 |
| 优势 | ______ | ______ |
| 不足 | ______ | ______ |
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啤酒酵母是啤酒工业发酵菌种，对啤酒的品质、风味有很大影响。请回答：
（1）科研人员将表达乙肝病毒表面抗原的基因构建在重组质粒中，进而转入___，发酵生产 转基因酵母乙肝疫苗。在构建重组质粒过程中，通过同种限制性核酸内切酶（-G↓AATTC-）切割得到的一个目的基因和一个开环质粒，共有 __（A．1 个 B．2 个 C．3个D．4 个）粘性末端。将重组质粒导入受体细胞的操作步骤完成以后，需要对所有受体细胞进行筛选，这是因为___。该转基因技术实践应用的成功标志是 __。
（2）转基因技术结合胚胎工程在高等动物育种中也有成熟应用。人们将经过基因改造的胚胎干细胞核与 __融合，得到___，并促使其在体外分裂发育成 __，再通过胚胎移植获得后代。目前胚胎移植是胚胎工程中获得后代的唯一方法，其原因是 __。
（3）胚胎干细胞具有重要的生产和临床医学价值。在培养胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层细胞，称为 __，其作用是 __。
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下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：
资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。
资料3:限制酶酶切位点
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。
（2）用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒，导入大肠杆菌体内，目的是_________________________________。
（3）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。
（4）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（5）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。
（6）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。
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人参是珍贵的药用植物，研究人员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原( HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过程如图所示，图中SmaⅠ、SstⅠ、 EcoRV为限制酶。请回答相关问题：
(1)②的构建过程除限制酶外还需要___________酶；想要从②中重新获得 HBSAg基因，所用的限制酶不能是EcoRⅤ或SmaⅠ，原因是_________________________________。
(2)将重组质粒转入农杆菌常用___________处理細胞：要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有______________________。
(3)分析图可知，②中应含有的标记基因是___________；过程⑤的目的是___________。
(4)研究人员将 HBsAg基因表达蛋白上的某位点氨基酸进行替换，通过一定的方法获得了新 HBsAg基因，进而获得了免疫效应更强的疫苗，请按照蛋白质工程的原理写出获得新 HBsAg基因的基本途径___________。
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人参是珍贵的药用植物，研究人员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过裎如图所示，图中SmaⅠ、SstⅠ、EcoRV为限制酶。请回答相关问题：
（1）②的构建过程除限制酶外还需要_________酶；想要从②中重新获得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRV或SmaⅠ，原因是_____________________________。
（2）将重组质粒转入农杆菌常用__________处理細胞；要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有____________________。
（3）分析图可知，②中应含有的标记基因是_______________；过程⑤的目的是______________。
（4）该疫苗进入机体后可刺激机体产生能与乙肝病毒特异性结合的_____________，同时还能产生______使机体长期对乙肝病毒具有免疫力。
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人参是珍贵的药用植物，研究人员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过裎如图所示，图中SmaⅠ、SstⅠ、EcoRV为限制酶。请回答相关问题：
（1）②的构建过程除限制酶外还需要_________酶；想要从②中重新获得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRV或SmaⅠ，原因是_____________________________。
（2）将重组质粒转入农杆菌常用__________处理細胞；要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有____________________。
（3）分析图可知，②中应含有的标记基因是_______________；过程⑤的目的是______________。
（4）该疫苗进入机体后可刺激机体产生能与乙肝病毒特异性结合的_____________，同时还能产生______使机体长期对乙肝病毒具有免疫力。
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研究人员将乙肝病毒的表面抗原（HBsAg)基因转入番茄幼叶细胞中，获得能产生乙肝疫苗的番茄植株。回答下列问题：
（1）利用PCR技术扩增HBsAg基因时，目的基因DNA受热变性后的单链与引物互补序列结合，在_______酶的作用下进行延伸。设计的引物含有ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点，用作载体的DNA分子________(填“含有”或“不含有”）ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点，理由是________________。
（2）将HBsAg基因导入番茄幼叶细胞最常用的方法是______________，该方法可以使目的基因插入到细胞中______________的DNA上。
（3）可利用植物组织培养技术获得转基因番茄植株，该技术利用的原理是________________。
（4）通过电镜对番茄果实提取物进行观察，发现了HBsAg颗粒，说明目的基因导入受体细胞后_________。用获得的转基因番茄果实饲喂小鼠，如果在小鼠血清中检测到_____________，说明转基因植物疫苗可口服。
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应用基因工程方法将酵母菌改造成能生产乙肝疫苗的“工程菌”时，应向酵母菌导入
A．乙肝病毒的表面抗原 B．抗乙肝病毒抗体的基因
C．抗乙肝病毒的抗体 D．乙肝病毒的表面抗原的基因
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应用基因工程方法，可将酵母菌制造成“工程菌”，用于生产乙肝疫苗，在制造该“工程菌”时，应向酵母菌导入( )
A.乙肝病毒的表面抗原
B.抗乙肝病毒抗体的基因
C.抗乙肝病毒的抗体
D.乙肝病毒的表面抗原的基因