【生物——选修1：生物技术与实践】自生固氮菌是一类能独立固定氮气的细菌，其中有些好氧的种类...

【生物——选修1：生物技术与实践】

自生固氮菌是一类能独立固定氮气的细菌，其中有些好氧的种类能产生PHB（一种可以被生物降解的塑料）。现欲获得高产PHB的自生固氮菌菌种，操作流程如下：采集土样→富培养→分离、纯化培养→初步筛选产PHB的自生固氮菌→筛选高产PHB固氮菌→保存备用。 回答下列问题：

（1）富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加_________。培养时要将装有培养液的锥形瓶旋转在摇床上，其目的是_________________。

（2）进行分离、纯化培养时，要先将培养基倒入培养皿中，制成平板。此时所使用的培养基与富集培养时有所不同，其中添加了一定量的_______________。倒平板时，要待高压灭菌后的培养基____________，再在______________附近操作。平板冷凝后，需置于恒温箱中1-2天后再用于接种，目的是______________。

（3）分离纯化培养后，得到8种形态特征有所不同的单菌落。经染色鉴定，其中3种能产生PHB，那么如何进一步筛选出高产PHB的菌种呢？请说出你的实验思路。

_______

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自生固氮菌是一类能独立固定氮气的细菌，其中有些好氧的种类能产生 PHB（一种可以被生物降解的塑料）。现欲获得高产 P HB 的自生固氮菌菌种，操 作流程如下：采集土样-富集培养-分离、纯化培养-初步筛选产 PHB 固氮菌-筛选高产 PHB 固氮菌-保存备用。

回答下列问题：

（1）富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加_____。培养时要将装有培养液的锥形瓶放置在摇床上，其目的是_____。

（2）进行分离、 纯化培养时， 要先将培养基 倒入培养皿中 ，制成平板。 此时所使用的 培养 基与富集培养时有所不同，其中添加了一定量的_____。倒平板时，要待高压灭菌后的培养基_____，再在_附近操作。平板冷凝后，需置于恒温箱中 1-2天后再用于接种，目的是_____。

（3）分离纯化培养后，得到 8 种形态特征有所不同的单菌落。经染色鉴定，其中 3 种能产 生 PHB。那么如何进一步筛选出高产 PHB 的菌种呢？请说出你的实验思路_____。

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回答下列（一）、（二）小题：

（一）自生固氮菌是一种能独立固定氮气的细菌，其中有些好氧种类能产生PHB（一种生物可降解的热塑性塑料）。现欲从活性污泥中分离、纯化、筛选出高产PHB的固氮菌，操作流程如下：采集土样→富集培养→分离、纯化培养→初步筛选PHB固氮菌→筛选高产PHB固氮菌→保存备用。请回答：

（1）富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加___________。培养时要将装有培养液的锥形瓶放置在摇床上振荡培养，其目的是为细菌的生长提供。

（2）用于筛选高表达量菌株的方法之一是经涂布分离获得__________。进行分离、纯化培养时，要先将培养基倒入__________中，制成平板，此时所使用的培养基与富集培养时有所不同，添加了一定量的__________。

（3）在纯化过程中，在固体培养基上划线时，下列操作正确的是__________。

A.接种环采用70%酒精灭菌

B.接种时应在酒精灯火焰附近进行

C.划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连

D.划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种

（二）下图表示细胞融合技术的部分过程，请回答：

（1）若甲、乙细胞是植物细胞，在细胞融合时，首先需将___________消化除去。获得的丁细胞在植物组织培养是通过平衡___________配比进行调控，从而实现植物器官、组织的发生和形态建成。

（2）若该过程是制备癌胚抗原单克隆抗体的部分过程，实验中首先将___________注入小鼠体内，然后从产生免疫反应的小鼠脾脏中获取经免疫的___________细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，筛选出___________细胞。

（3）若甲、乙细胞到丙细胞过程是哺乳动物体外受精过程，甲、乙细胞能够结合的基础是细胞膜表面有特异性___________功能的蛋白。若丁细胞为囊胚的外表扁平细胞，由其组成的结构称为___________。

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甲、乙两位同学从实际出发着手准备如下实验。甲同学想从土壤中分离出自生固氮菌（一类能独立固定氮气的细菌）。查阅资料得知, 细菌的直径大小通常在0.5~5μm之间，某针筒式微孔过滤器（滤膜孔径0.22微米，如图），耐热性稳定。乙同学想充分利用当地的特有资源——柠檬来提取柠檬精油，查阅资料得知柠檬精油是挥发性物质。回答下列问题：

（1）从甲同学查阅的资料进行思考，如何配制含有不耐高温药品A的无菌培养液？________________（在无菌环境中操作）。

（2）甲同学进行富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加_________营养物质。培养时要将装有培养液的锥形瓶放置在摇床上，其目的是提高培养液中的_____________，同时使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。进行分离、纯化培养时，要先将培养基倒入培养皿中，制成平板。如何判断所制作的平板没有被微生物污染？_____________。

（3）乙同学想通过水中蒸馏法提取柠檬精油，可以吗？___________________。请你说出理由：________________________。

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土壤生活着许多异养型微生物，其中自生固氮微生物可以将空气的氮气固定为氨气，纤维素分解菌可以将纤维素分解产生葡萄糖。请回答下列问题：

（1）欲从土壤中分离纤维素分解菌和自身固氮微生物，从微生物所需的营养物质分析，需将土壤浸出液分别接种在___________和___________的选择培养基中，分别记为培养基A和B。

（2）配置好的培养基一般会釆用___________法灭菌。接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是_________________________________。经过稀释涂布平板法接种培养后，统计得到的纤维素分解菌的菌落数应该比样液中活菌数_____________________。

（3）科研工作者将两种菌混合培养在培养基A或B中所得的到的菌落数都大于单独培养，从微生物营养物质的种类分析出现此现象的原因是_____________________。

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（二）回答下列有关微生物的问题。

自生固氮菌是在土壤中能够独立进行固氮的细菌，对于增加土壤中的氮素有重要意义。某研究小组按照下列实验方案（如图）从土壤中分离自生固氮菌株。

1. 下列属于自生固氮菌生物学特征的是__________。

A. 具有质膜和核糖体　　 B. 厌氧型细菌

C. 所需能量由自身的线粒体提供　　 D. 单细胞真核生物

2. 按功能分，Ⅰ号培养基称为__________培养基；该培养基中应有的营养成分（仅列出了碳氮源）为___________。

A. 葡萄糖、硫酸铵　　 B. 葡萄糖　　 C. 牛肉膏、蛋白胨　　 D. 牛肉膏

3. 从配制培养基到制备平板的过程中，不需要的是__________。

A. 酒精灯　　 B. 接种环　　 C. 灭菌锅　　 D. 玻璃棒

4. 接种后的平板放在28℃恒温箱培养3-4天，通过观察__________的特征可统计自生固氮菌的种类，但培养时间不宜过长的原因是__________________。

草甘膦是目前农业上广泛使用的一种除草剂，其田间推荐使用的中间浓度为C，但未考虑它对固氮微生物的影响，研究小组采用“抑菌圈法”对此开展研究（见如表），以期为农田合理使用草甘膦提供理论依据。

5. 补全表中的实验方案：

如表草甘膦的抑菌圈直径比较

_____________

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下列有关固氮微生物叙述不正确的是：

A．固氮微生物主要指具有固氮功能的细菌，包括共生固氮菌和自生固氮菌

B．不同的根瘤菌，各自只能侵入特定种类的豆科植物，并与该豆科植物共生

C．生物固氮是指固氮微生物将大气中的氨转变成硝酸盐的过程

D．根瘤菌和圆褐固氮菌的新陈代谢类型均为异养需氧型

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我省属黄土高原半干旱地区，向土壤中添加玉米秸秆，通过微生物作用加以分解，可有效改良土壤。中北大学某研究小组欲筛选玉米秸秆纤维素分解菌及自生固氮菌(能够独立进行固氮的细菌)，组成复合微生物添加剂用以改善我省土质。下表为本实验两种相关培养基配方，请回答：

(1)两种培养基中，能用于筛选自生固氮菌的是___________，理由是___________。另一种培养基中需加入___________，筛选纤维素分解菌。

(2)筛选出纤维素分解菌(命名为X)后，需进行玉米秸秆降解能力测定，玉米秸秆主要为X提供___________。

(3)分离纯化得到自生固氮菌(命名为N)并对其进行发酵培养，要测定发酵液中该菌的数目，可在显微镜下用___________直接计数，该方法的测量值比活菌的实际数目___________。

(4)无菌操作在相关培养基上均匀涂布N(或X)，晾干后在其表面接种X(或N)，适宜条件下培养一段时间后，若X(或N)周围___________(填“有”或“无”)抑菌圈(细菌生长受到抑制形成的透明圈)出现，则两种微生物适合联合施用，原因是___________。

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我省属黄土高原半干旱地区，向土壤中添加玉米秸秆，通过微生物作用加以分解，可有效改良土壤。某大学某研究小组欲筛选玉米秸秆纤维素分解菌及自生固氮菌（能够独立进行固氮的细菌），组成复合微生物添加剂用以改善我省土质。下面为本实验两种相关培养基配方，请回答：

培养基1：CMC - Na、NaCl、KH2 PO4，MgSO4·7H2O、蛋白胨、琼脂、蒸馏水

培养基2：KH2 PO4，NaCl、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水

（1）培养基1中主要碳源是______ 。两种培养基中，培养基2能用于筛选自生固氮菌因为___________。

（2）欲用培养基1筛选出纤维素分解菌，培养基1中还需要加___________，在筛选出纤维素分解菌（命名为X）后，需进行玉米秸秆降解能力检测，一般采用对___________进行定量的测定。

（3）分离纯化得到自生固氮菌（命名为N）并对其进行发酵培养，要测定发酵液中该菌的数目，可用活菌计数法或_____， 后者计数方法的测量值一般比活菌的实际数目___________。

（4）无菌操作在相关培养基上均匀涂布N（或X），晾干后在其表面接种X（或N），适宜条件下培养一段时间后，若X（或N）周围______（填“有”或“无"）抑菌圈（细菌生长受到抑制形成的透明圈）出现，则两种微生物适合联合施用，原因是___________。

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圆褐固氮菌是自生固氮细菌（能自主将大气中的氮气转化为氨），代谢类型是异养需氧型。某同学采用稀释涂布平板法从土壤中分离获得圆褐固氮菌。回答下列问题。

（1）分离不同的微生物要采取不同的稀释度，原因是_______________。初次实验时，可以将稀释的范围放宽一点，以保证能从中选择出菌落数在__________间的平板进行计数。

（2）培养圆褐固氮菌时不能隔绝空气的理由是____________________（答出两点）。

（3）用该方法统计的菌落数量往往比活菌的实际数量少，原因是____________________。

（4）保藏菌种时，可采用__________方法进行长期保存。

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