猪场污水中的氮素是一类主要的水体污染物。B2菌株能有效地去除氨氮进行脱氮，关于B2菌株的分...

猪场污水中的氮素是一类主要的水体污染物。B2菌株能有效地去除氨氮进行脱氮，关于B2菌株的分离与鉴定，回答下列问题：

（1）进行脱氮微生物初步筛选时，通常采用_______法和________法进行接种。

（2）在制备培养基倒平板时，待平板冷凝后倒置，倒置的目的是________。平板应放在培养箱里空白培养1-2d，观察是否有菌落生成，其目的是________。对分离得到的菌株B2可通过观察菌落的_________进行形态学鉴定。

（3）某科研小组研究了不同温度对B2菌株氨氮降解率的影响，结果如下表：

本实验的自变量为_______，因变量是______ ，结论是_______。

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近年来，在处理富营养化水体的污水过程中，与化学、物理除氮方法比较，目前认为微生物反硝化去除氮素污染更为经济有效。科研工作者采用基因工程技术构建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，进行了相关研究。请回答问题。

（1）微生物的反硝化作用，是氮循环中一个重要的生物过程。亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）转录后，再翻译出具有___________作用的蛋白质。

（2）工程菌的构建

①研究者利用NCBI数据库查到nirS基因的碱基序列，设计引物，利用PCR技术扩增nirS基因。PCR技术利用了___________的原理，使用耐高温Taq酶而未使用普通DNA聚合酶的主要原因是______________________。

②研究者用HindⅢ和BamHI两种限制酶处理nirS基因与p质粒，在_______________酶的作用下进行体外连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5，在含庆大霉素的培养基中进行培养并提取质粒，如果用HindⅢ和BamHI双酶切，得到两个片断电泳结果分别与_______________电泳结果基本一致，说明获得重组质粒pYP4S。

③将pYP4S转化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培养后进行PCR鉴定。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图1所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是_________。某学生错选了图中的另外一对引物组合，扩增出长度为2．1kb的片段，原因是_______________。

（3）检测工程菌YP4S除氮的效能

①工程菌株YP4S在已灭菌的模拟污水中培养36h后，检测结果如图2。结果表明___________________。

②要进一步证明工程菌对含氮污水治理更有效，应___________________________。

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近年来，在处理富营养化水体的污水过程中，与化学、物理除氮方法比较，目前认为微生物反硝化去除氮素污染更为经济有效。科研工作者采用基因工程技术构建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，进行了相关研究。请回答问题。

（1）微生物的反硝化作用，是氮循环中一个重要的生物过程。亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）转录后，再翻译出具有___________作用的蛋白质。

（2）工程菌的构建

①研究者利用NCBI数据库查到nirS基因的碱基序列，设计引物，利用PCR技术扩增nirS基因。PCR技术利用了___________的原理，使用耐高温Taq酶而未使用普通DNA聚合酶的主要原因是______________________。

②研究者用HindⅢ和BamHI两种限制酶处理nirS基因与p质粒，在_______________酶的作用下进行体外连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5，在含庆大霉素的培养基中进行培养并提取质粒，如果用HindⅢ和BamHI双酶切，得到两个片断电泳结果分别与_______________电泳结果基本一致，说明获得重组质粒pYP4S。

③将pYP4S转化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培养后进行PCR鉴定。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图1所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是_________。某学生错选了图中的另外一对引物组合，扩增出长度为2．1kb的片段，原因是_______________。

（3）检测工程菌YP4S除氮的效能

①工程菌株YP4S在已灭菌的模拟污水中培养36h后，检测结果如图2。结果表明___________________。

②要进一步证明工程菌对含氮污水治理更有效，应___________________________。

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为更好地解决冬季污水处理厂氨氮去除率低的问题，某研究小组进行了低温下高效硝化细菌培养的研究。硝化细菌基本培养基的主要成分如下表：

（1）硝化细菌能够利用　　　　 的反应中所释放的化学能，将二氧化碳和水合成为糖类，这种合成作用叫做　　　　　　　　 。

（2）硝化细菌基本培养基的成分中，提供氮源的物质是　　　　　　 ，既能提供碳源又能够调节PH的物质是　　　　　 。该培养基与培养大肠杆菌的培养基相比，营养成分上最显著的区别是　　　　　　　　 。

（3）为了分离到氨氮去除率高的硝化细菌，用于筛选时的培养基成分需要调整，即　　　　　　　 ；同时，要注意控制　　　　 、　　　　　 和pH等培养条件。

（4）为了观察硝化细菌菌落的大小、隆起程度、　　　　 等菌落特征，可用稀释涂布平板法在固体培养基表面获得单个菌落，进行涂布平板操作前，要对涂布器进行灭菌，一般做法是先将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，然后　　　　　 。

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[生物一选修1:生物技术实践]

某小组开展“市售鲜猪肉中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析”的研究，进行了相关实验操作，回答下列问题：

（1）菌株的分离纯化:切取鲜猪肉表层样品接入蛋白胨大豆肉汤培养基中，放在37℃摇床振荡培养18h。取肉汤接种于琼脂平板培养基上，培养后再挑取单菌落，接种培养，培养一段时间后，再次挑取单菌落接种于固体培养基上，多次重复此步骤。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的______________；操作过程中液体培养的目的是______________，反复接种固体培养基的目的是____________________________。

（2）下面是纸片扩散法对猪大肠杆菌的耐药性实验。

步骤1:用打孔器制成直径约6 mm的圆形滤纸片，浸入一定浓度的氨苄西林，烘干；

步骤2:取含大肠杆菌的菌液均匀涂布于______________上；

步骤3：在培养基上，每隔一定距离贴一片含药物的圆形滤纸片，培养，观察。

分析与评价：

①观察发现，在每个纸片周围都形成了抑菌圈，其直径的大小表示大肠杆菌对氨苄西林的敏感性。抑菌圈直径越大，敏感性越______________（填“高”或“低”）。

②发现在抑菌圈外长满多种不同形态的菌落，其原因可能是_________________________。

③欲比较五倍子和黄连提取液对猪大肠杆菌的抑制作用，为治疗提供依据。请写出实验思路:________。

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某研究者拟从植食性动物的粪便中筛选高产纤维素酶菌株，并对菌株进行鉴定和产酶条件的优化，以期为纤维素酶制剂研制提供基础。据此回答下列问题：

（1）从植食性动物粪便中能分离出纤维素分解菌的原因是______ ；而纤维素分解菌能产生纤维素酶，纤维素酶是由________组成。

（2）在对菌株进行鉴定和产酶条件的优化过程中，需将富集培养后植食性动物的粪便混合菌适当稀释后涂布于以________作唯一碳源的选择培养基上，倒置放入37℃恒温培养箱中培养24h，在系列稀释操作中，用移液管使菌液与水充分混匀时所进行的操作是_________。

（3）筛选获得纤维素酶高活性菌株3株，分别命名为A、B、C。在相同培养基上培养一段时间后，测得3种菌株的菌落直径与刚果红透明圈直径，结果如下表：

由表可知，_______菌株纤维素酶的活性最强。

（4）若将纤维素分解菌细胞内的酶提取出来后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，与相对分子质量较小的蛋白质相比，其移动速度_______（填“较快”或“较慢”或“基本相同”），原因是_________。

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煤化工污水是一种含盐量较高的难降解的工业废水，为了提高生化处理的效果，研究人员从煤化工企业生产污水中分离出一株耐盐菌株，对耐盐菌进行初筛和复筛所用的培养基成分如下表所示。请回答下列问题：

（1）要从煤化工企业生产污水中筛选耐盐菌的原因是________________________________________。

（2）分析培养基成分，培养基中加入葡萄糖的作用是________________________（答出2点即可）；将煤化工污水经富集培养后接种到初筛培养基可用的方法是________________________，初筛的目的是选择出耐盐效果较好的菌落；和初筛培养基相比，复筛培养基从物理性质上划分属于________培养基，复筛的目的除了进一步筛选耐盐菌外，还能________________。对筛选出的耐盐菌菌种要长期保存可采用________的方法。

（3）某同学利用显微镜观察并统计了复筛后培养基中耐盐菌的数量，该方法统计微生物数量时应将菌液转移到________________中进行，该方法最大的缺陷在于___________________________。

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运用所学知识回答下列与生物技术实践相关的问题。

（1）某科普实验小组欲从石油污染的水域中筛选出能高效降解石油的微生物。请回答：

①从水体中分享纯化菌种时，若要获得纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是＿＿＿，操作时采用＿＿＿灭菌的方法。

②在筛选过程中，应将稀释接种于以石油为唯一碳源的固体培养基上，在微生物培养前，需对培养基进行＿＿＿，该培养基从功能上看属于＿＿＿＿

（2）进行月季花药离体培养时，选择合适发育时期的花粉能提高诱导成功率，确定花粉发育时期最常用的染色方法是＿＿＿＿＿。花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中＿＿＿＿

（3）葡萄皮、籽中含有原花青素、葡萄皮红素和大量葡萄风味物质等，这些物质易溶于乙醇、乙酸乙酯中，因此常采用＿＿＿＿法来分离提取，还可以用＿＿＿＿和蒸馏等提取什物芳香油的方法。

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烷烃是石油的主要成分，利用微生物降解烷烃是治理石油污染的一种方法。为了获得和研究烷烃降解菌，某研究小组进行了烷烃降解菌的分离、鉴定等工作。回答下列问题：

(1)从石油污染地区的土壤中取样，用以___________为唯一碳源的液体培养基进行培养。

(2)将上述培养后的微生物用___________法进行分离纯化时，需要将菌液进行一系列的梯度稀释，其目的是___________。此外，常用的微生物分离纯化的方法还有___________。

(3)从平板中挑取单个菌落，接种到液体培养基中，在摇床上振荡培养24h，振荡的目的是___________。为保存菌种，可取1mL菌液与___________充分混匀，置于－20℃冰箱中。

(4)若从挑取的单个菌落中鉴定出了两种烷烃降解菌，其原因最可能是___________。

(5)为研究烷烃降解菌种群数量变化规律，定期从菌液中抽样，采用___________对其进行计数，最终绘制出种群数量变化曲线图。

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为更好地解决冬季污水处理厂氨氮去除率低的问题，某研究小组尝试从海水中筛选在低温下能高效去除氨氮的硝化细菌。将采集到的海水样本加入液体培养基A（其氮源为氨态氮），放在24℃的培养箱中培养5天，然后取少量培养液在固体培养基上涂布，得到三种形态、颜色均不相同的单菌落。回答下列问题：

（1）液体培养基A应选用的灭菌方法是______________（填“高压蒸汽灭菌”或“干热灭菌”），不选另外一种的原因是___________________________________________________________。

（2）在配制培养基A时，对碳源的要求是___________（填“提供有机碳源”或“不提供碳源”），理由是___________________________________________________________________。

（3）最后分离得到的单菌落有三种，其形态、颜色各不相同，表明硝化细菌____________。

（4）该研究小组在上述实验的基础上，已经获得了高效去除氨氮的硝化细胞，则需要经过__________处理，才能筛选出符合要求的能高效去除氨氮的硝化细菌。

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