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血管内皮生长因子（VEGF）是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。
研究人员利用pVAX1质粒和VEGF基因构建了PVAX1—VEGF的DNA疫苗，为肿瘤免疫治疗奠定基础。回答下列问题：
（1）首先从人的肺癌细胞株A549中提取mRNA，通过_______法获得VEGF基因。
（2）对获取的VEGF基因进行PCR扩增前，需要根据VEGF基因序列设计两种引物，其原因是_________。为便于VEGF基因与质粒pVAX1连接，引物中要增加适当的__________。扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中______过程的温度设定是扩增成败的关键。
（3）构建的PVAX1—VEGF上应含有特定的______（填“复制原点”或“启动子”或“标记基因”），它能被受体细胞的_______所识别，以便于催化转录过程。
（4）DNA疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是________________。
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肿瘤血管生长是肿瘤生长的关键环节，血管内皮生长因子（VEGF）是一种参与促进肿瘤血管生长的蛋白质，VEGF作为治疗癌症的靶分子受到了很多研究者的关注。
（1）VEGF 的受体存在于血管内皮细胞的_____，可促进血管内皮细胞的_______，形成的细胞最终构成新的血管。
（2）研究者利用噬菌体文库筛选能与VEGF特异性结合的多肽。过程如下。
①将人工合成的编码随机六肽的基因插入噬菌体DNA，形成重组DNA分子，用重组DNA分子转化大肠杆菌，大肠杆菌经培养后裂解，产生噬菌体。这些噬菌体构成一个文库，一个包含所有可能六肽的噬菌体文库至少有____种噬菌体组成，在这些噬菌体中可能有某种六肽能与VEGF特异性结合（图一）。
②将VEGF能够与受体结合的部位固定在微孔容器底部，在微孔中加入随机肽文库，一段时间后用缓冲液洗去不能与VEGF结合的噬菌体，然后用含有_____的缓冲液将结合在微孔底部的噬菌体洗脱下来，这种分子能够与微孔容器底部的分子竞争性结合噬菌体，这说明噬菌体与目标分子的结合是_____（可逆或不可逆）的。
③将洗脱下来的噬菌体转入另一试管，加入_____，经过一段时间振荡培养，产生新一代噬菌体库。
④重复步骤②③多次。
（3）在多轮实验后产生的噬菌体文库比第一代噬菌体文库与VEGF的结合能力更强，文库中噬菌体的种类_____，请分析原因：_____。
（4）欲证明筛选到的多肽X能够起到抑制肿瘤生长的作用，研究者设计了这样的实验：将多肽X溶液注射到⼀只肿瘤模型小鼠体内，（肿瘤型鼠是天然条件下就会产生肿瘤的小鼠品系），检测VEGF与VEGF受体的结合能力。请对该实验做出评价并加以完善___________________________________。测VEGF与VEGF受体的结合能力。请对该实验做出评价并加以完善___________________________________。
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神经纤毛蛋白-1（NRP-1）是血管内皮生长因子的新型受体，经实验证明，与正常组织细胞相比，NRP-1在乳腺癌（MCF7）细胞中高表达，通过参与多种信号转导来促进肿瘤血管的生成，进而促进肿瘤体积的增长。本研究将为 NRP-1 单克隆抗体靶向治疗乳腺癌提供数据基础。
（1）取乳腺癌（MCF7）组织块，运用____________________技术获得 MCF7 细胞用于后续实验。用人的_____________________蛋白对小鼠进行注射，使小鼠产生免疫反应，制备杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞转到多孔培养板上培养，吸取培养孔中的________________（填上清液或沉淀细胞），应用_________________技术进行抗体阳性检测。经多次筛选和细胞培养，获得 NRP-1 单克隆抗体（NRP-1 MAb）。
（2）将 MCF7 细胞制成单细胞悬液，等量注入 4 组裸鼠（即无胸腺裸鼠）右前腋下，接种后 3 天开始给药NRP-1 单克隆抗体（NRP-1 MAb），共给药 7 次，对照组注射等量的生理盐水。每隔 5 天测算一次肿瘤的体积，如下图所示：
从上图中可以看出_________________________
（3）结合题干信息，综合以上研究请你推测 NRP-1 MAb 抑制肿瘤的作用机理是_____________________。
（4）注射不同剂量 NRP-1 MAb 33 天后，剥离肿瘤组织称重，实验结果如下图：
从该结果中可以看出___________________________。综合比较（3）和（5）的实验结果，可见中高剂量和低剂量的 NRP-1 MAb 在降低肿瘤体积和降低肿瘤重量上出现了不一致性。通过实验研究，有助于指导实践中科学用药。
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神经纤毛蛋白-1 (NRP-1) 是一种多功能糖蛋白，在多种肿瘤组织中呈高表达，可与血管内皮生长因子结合促进肿瘤血管的形成，使肿瘤体积增大。科研人员通过制备NRP-1单克隆抗体，开展对小鼠的乳腺癌肿块进行靶向治疗的研究。请分析回答：
（1）制备单克隆抗体涉及的动物细胞工程常用技术手段有_________________________(写出两项)。
（2）制备时，首先给小鼠注射___________________________，分离得到B细胞。将B细胞与骨髓瘤细胞诱导融合后得到杂交瘤细胞，经系列处理选出______________________细胞注射到小鼠腹腔中，从腹水中提取到大量的NRP-1单克隆抗体。
（3）为了论证制取的单克隆抗体的治疗效果，研究者选择生长状况一致的小鼠，分别注射等量的乳腺癌细胞悬液，经饲养后，各小鼠均形成了体积基本相同的肿瘤。
①将上述小鼠随机分成实验组和对照组，实验组和对照组应分别注射____________，___________________，且每隔3天重复进行相同的注射操作，一段时间后测算发现，实验组小鼠的肿瘤体积都小于对照组，原因可能是_________________________发生特异性结合，阻断了___________________________的结合，从而抑制了肿瘤内血管生成，导致肿瘤体积减小。
②上述实验小鼠应选用没有___________________(器官)的动物模型鼠，由于这种鼠存在免疫缺陷，实验时可以避免小鼠的免疫系统对NRP-1单克隆抗体和乳腺癌肿块进行攻击，从而保证实验结果更可靠。
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血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的诱导肿瘤血管生成的最强烈的血锌生成因子，针对VEGF生产的抗肿瘤药物，是治疗癌症的一个方向；芝加哥大学的Katherine Knight博士成功地在转基因兔中获得骨髄瘤样肿瘤，经技术改进，能高产量地生产兔单克隆抗体：我国江苏省某公司首次在全球成功开发出人源化兔单抗药物“注射用人源化抗VEGF单克隆抗体”（SIM63）,有效打破了跨国公司的技术垄断。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。请回答下列相关问题：
（1）动物细胞在体外培养的技术属于 工程，由于人们对动物细胞所需的营养物质没有完全搞淸楚，在使用合成培养基时，通常需要加入 等一些天然成分：在培养时除提供细胞所需的O2外，还需要CO2，其作用是 。
（2）在基因工程中，将目的基因导入动物细胞现今极常用、极有效的方法是 ，要在短时间内扩增大量的目的基因采用 技术，这个技术中的关键酶是 。
（3）当VEGF作为抗原进入动物体内时，动物体内的某些B细胞分化为浆细胞，这种浆细胞只分泌针对VEGF的一种抗体，但B细胞在体外培养不会无限增殖，解决这一问题的方法是通过动物细胞融合技术得到杂交瘤细胞，常用的化学诱导融合试剂为 ，要分离出杂交瘤细胞,应该用 培养基进行筛选，单克隆抗体最主要的优点是它的 ,并可大量制备。
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肿瘤的生长依赖于新生血管，血管内皮生长因子(VEGF)是目前公认最关键的促血管形成因子。为研究促性腺激素释放激素(GnRH)类似物(药物甲)、“顺铂”(一种化疗药物乙)及其联合作用对卵巢癌动物血管生成的影响，研究人员以卵巢癌细胞为研究对象，检测细胞中血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质的含量。
材料与用具：3 mg/L顺铂、10－7 mol·L－1 GnRH类似物、胰蛋白酶、12孔细胞培养板(每个孔可进行细胞培养)、卵巢癌细胞、细胞培养液、CO2培养箱。
(要求与说明：不考虑加入顺铂和GnRH类似物对体积的影响；VEGF的mRNA和蛋白质含量的具体检测步骤不作要求；实验条件适宜)
(1)实验思路：(其中药物加入设计画在下面的12孔细胞培养板示意图中即可，无需再文字说明；药物可用甲、乙表示；药物作用3天，每24 h检测一次，无需前测；重复实验不要求)
____________________________________
(2)若GnRH类似物、顺铂都能抑制血管生成，且联合作用效果更佳。请画出药物作用48 h时血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质相对含量的柱形图。
__________________________________
(3)实验分析：
①促性腺激素释放激素由________产生。
②如果已得到上述第(2)小题中的实验结果，为了进一步在活体水平上验证这两种药物及其联合作用的影响，下一步你将选用身体状况一致的________动物，随机均分后，分组进行药物处理，观察__________。
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神经纤毛蛋白-1（NRP-1）是血管内皮生长因子的新型受体，通过参与多种信号转导来促进肿瘤血管的生成。本研究将为NRP-1单克隆抗体靶向治疗乳腺癌提供数据基础。
（1）取乳腺癌（MCF7）组织块，运用__________技术获得MCF7细胞用于后续实验。用重组的人_________蛋白对小鼠进行注射，使小鼠产生免疫反应，制备杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞转到多孔培养板上培养，吸取培养孔中的__________（填“上清液”或“沉淀细胞”），应用__________技术进行抗体阳性检测。经多次筛选和细胞培养，获得NRP-1单克隆抗体（NRP-1 MAb）。
（2）提取正常组织细胞和MCF7细胞的总蛋白，设置空白对照，加入NRP-1 MAb进行蛋白质免疫印迹，实验结果如下：
该实验结果说明了__________。
（3）将MCF7细胞制成单细胞悬液，等量注入4组裸鼠右前腋下，接种后3天开始给药，共给药7次。每隔5天测算一次肿瘤的体积，如下图所示：
对照组注射__________，从上图中可以看出__________。
（4）结合题干信息，综合以上研究请你推测NRP-1 MAb抑制肿瘤的作用机理是__________。
（5）注射不同剂量NRP-1 MAb 33天后，剥离肿瘤组织称重，实验结果如下图：
从该结果中可以看出____。综合比较（3）和（5）的实验结果，可见中高剂量和低剂量的NRP-1 MAb在降低肿瘤体积和降低肿瘤重量上出现了不一致性。
（6）基于以上研究，科学家们对该抗体的用药方式有两种观点：谨慎用药和适宜浓度用药。你支持哪个观点，并说出理由______。
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神经纤毛蛋白-1（NRP-1）是血管内皮生长因子的新型受体，通过参与多种信号转导来促进肿瘤血管的生成。本研究将为NRP-1单克隆抗体靶向治疗乳腺癌提供数据基础。
（1）取乳腺癌（MCF7）组织块，运用__________技术获得MCF7细胞用于后续实验。用重组的人_________蛋白对小鼠进行注射，使小鼠产生免疫反应，制备杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞转到多孔培养板上培养，吸取培养孔中的__________（填“上清液”或“沉淀细胞”），应用__________技术进行抗体阳性检测。经多次筛选和细胞培养，获得NRP-1单克隆抗体（NRP-1 MAb）。
（2）提取正常组织细胞和MCF7细胞的总蛋白，设置空白对照，加入NRP-1 MAb进行蛋白质免疫印迹，实验结果如下：
该实验结果说明了__________。
（3）将MCF7细胞制成单细胞悬液，等量注入4组裸鼠右前腋下，接种后3天开始给药，共给药7次。每隔5天测算一次肿瘤的体积，如下图所示：
对照组注射__________，从上图中可以看出__________。
（4）结合题干信息，综合以上研究请你推测NRP-1 MAb抑制肿瘤的作用机理是__________。
（5）注射不同剂量NRP-1 MAb 33天后，剥离肿瘤组织称重，实验结果如下图：
从该结果中可以看出____。综合比较（3）和（5）的实验结果，可见中高剂量和低剂量的NRP-1 MAb在降低肿瘤体积和降低肿瘤重量上出现了不一致性。
（6）基于以上研究，科学家们对该抗体的用药方式有两种观点：谨慎用药和适宜浓度用药。你支持哪个观点，并说出理由______。
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内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导入羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoRⅠ、SalⅠ、SphⅠ为限制酶。
请据图回答。
⑴在构建基因表达载体的过程中，应采用______（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是______。
⑵要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的______等调控组件重组起来，构建基因表达载体。
⑶图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是______。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②______技术可培育成转基因克隆山羊。
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内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊 发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导入羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoRⅠ、SalⅠ、SphⅠ为限制酶。
请据图回答。
⑴在构建基因表达载体的过程中，应采用______（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是______。
⑵要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的______等调控组件重组起来，构建基因表达载体。
⑶图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是______。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②______技术可培育成转基因克隆山羊。
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