右下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点...

右下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tct^R 为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答下列问题：

⑴将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。

⑵用上述几种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________________；

⑶在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________。

⑷基因工程是一柄“双刃剑”，一方面可以极大地提高栽培作物的基因潜力，打破了种间的______隔离，从变异的角度看，基因工程的原理是_____________；另一方面也可能给生态系统和人类带来安全隐患，举一例简要说明：_______________________。

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（8分）下图（一）为某基因工程中利用的质粒简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp^R为青霉素（抗生素）抗性基因，tct^R为四环素（抗生素）抗性基因。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。下图（二）为几种酶作用于基因的位置。请回答下列问题：

（1）在基因工程中常用的工具有三种：一是用作切取目的基因的________酶；二是将目的基因与运载体拼接的________酶；三是作为运载体的质粒。

（2）将含有目的基因的DNA与经特定的酶切后的运载体（质粒）进行拼接形成重组DNA，理论上讲，重组DNA可能有：目的基因－目的基因、目的基因－运载体和运载体－运载体三种，其中有效的（所需要的）重组DNA是________，因此需要对这些拼接产物进行分离提纯。

（3）利用图（一）所示的质粒拼接形成的3种拼接产物（重组DNA）导入无任何抗药性的原核宿主细胞，并接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的拼接产物（重组DNA）是________。含有效的重组基因（目的基因-运载体）的原核宿主细胞在含青霉素的培养基上_________（能/不能）生长。

（4）在动物基因工程中，将重组DNA导入受体细胞的常用方法是________ 。

（5）图（二）中，作用于a 位置的酶是________；作用于b 位置的酶是________。

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图1是科研工作者利用差异杂交法获取相关目的基因的研究；图2是克隆出的花色基因C，和实验所用质粒表达载体简图（箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRI、BamlI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点），拟将其与质粒重组，再借助农杆菌导入菊花中。请据图回答问题：

(1)图1中，A过程需要用____________酶，D过程需要筛选____________（填“未杂交”或“杂交分子”）的含32P的cDNA单链，继而通过人工合成，获得双链cDNA，并用其构建基因文库。

(2)图2中菊花组织培养的培养基常用_________方法灭菌。菊花的组织培养过程③需添加生长素和细胞分裂素，当其比值_________（升高/降低/适中）促进生根。

(3)图3表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入了农杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有__________、__________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是___________（填数字）菌落中的细菌。

(4)为确定基因C是否整合到菊花染色体的DNA上，可用放射性同位素标记的___________作为探针进行分子检测，还需要在个体水平上通过_________鉴定。

(5)本实验中，对质粒进行酶切时，只能单一酶切，不能双酶切，原因是____________。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。下图所示为6条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______________可以扩增出了450bp片段。若目的基因反向连接了，那么选图中引物__________，可从某一菌落的质粒中扩增出了500bp片段。

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如图为某质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制酶39．如图为某质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。又知植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。已知耐旱基因两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。据图回答：

（1）获得耐旱基因常用基因文库法。理论上，　　　　　　 文库中含有该生物的全部基因；而　　　　 文库中含有生物的部分基因。

（2）实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是　　　　　　　　 。酶切产物用DNA连接酶处理后，两两连接的产物有　　　　　　　　　 种。

（3）将上述连接产物导入无任何抗药性的宿主细胞后，将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能正常生长的宿主细胞所含有的连接产物是　　　　 　　　　 。

（4）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是　　　　　　　　 ，其合成的产物是　　　　　　　　 。

（5）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱植株与不耐旱植株的数量比为3：1时，则可推测该耐旱基因整合到了　　　　　　　　 （填“同染色体的一条上”或“同染色体的两条上”）。

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如图为某质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点．又知植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关．若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性．已知耐旱基因两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点．据图回答：

（1）获得耐旱基因常用基因文库法．理论上，_________________（填基因文库种类）中含有该生物的全部基因；而_________________（填基因文库种类）中含有生物的部分基因．将含有耐旱基因的DNA与该质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶处理后，两两连接的产物有_________种。

（2）将上述连接产物导入无任何抗药性的宿主细胞后，将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能正常生长的宿主细胞所含有的连接产物是___________________________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_______________，其合成的产物是_______________。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______________。

（5）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱植株与不耐旱植株的数量比为3：1时，则可推测该耐旱基因整合到了_______________________（填“同染色体的一条上”或“同染色体的两条上”）。

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如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶 EcoRI、 BamHI、SamI的酶切位点，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点，已知目的基因的两端分别有包括coRI、 BamHI、SamI在内的多种酶的酶切位点。外源DNA插入到或中会导致相应的基因失活（表示氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因）。回答下列问题：

（1）基因工程中获取目的基因常用的方法有_______________________（答出两点即可）。

（2）在基因工程中使用的载体除质粒外，还有__________、__________等。构建重组质粒时，为避免出现自身环化，通常选用____________酶对该质粒和目的基因进行切割，质粒被切割后断开了_________个磷酸二酯键。被切割后的质粒和目的基因经DNA连接酶连接后首先导入大肠杆菌中，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般需要用含_____________的培养基进行培养。

（3）将含有目的基因的重组质粒导入植物细胞最常用的方法是__________，为检测目的基因是否在受体细胞中表达，通常选用____________的方法进行分子水平的检测，此外有时还需要进行___________的鉴定。

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图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRI、BamHI、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是

A.如果用EcoRI对外源DNA和质粒进行酶切，将多个含有目的基因的DNA片段与多个质粒的酶切产物用DNA连接酶进行连接后，两两连接所形成的产物有三种

B.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRI酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRI酶切点有1个

C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时应使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理

D.如果要将重组DNA导入大肠杆菌细胞，则用氯化钙处理大肠杆菌可以增加其细胞壁的通透性，利于重组DNA的导入

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如图为某种质粒，小箭头所指为限制性内切酶EcoRⅠ的酶切位点，ampR为氨苄青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端包括EcoRⅠ在内的多种酶的酶切位点。请根据图

回答下列问题。

（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_________、_________、_________三种。将此三种连接产物与无任何抗药性的细菌A接种到含四环素的培养基中，能生长的细菌A所含有的连接产物是_________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长繁殖的细菌A所含有的连接产物是_________。

（2）假设人的生长激素基因，与上述质粒构建表达载体后导入细菌B（本身不含有氨苄青霉素和四环素抗性质粒），然后接种在一个只含有氨苄青霉素的培养基上，得到如图a所示的结果（圆点表示菌落），该结果说明能够生长的细菌中已经导入了_________，反之则没有导入；再将灭菌绒布按到培养基a上，使绒布表面沾上菌落，然后将绒布按到只含有四环素的培养基上培养，得到如图b所示结果（空心圆圈表示与图a中培养基上对照没有菌落的位置）。与图b圆圈相对应的图a中的菌落表现型是_________，这些菌落则是导入了_________的工程菌。

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下图是基因工程中构建生产人乳铁蛋白的重组载体。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindIII、SmaI直线所示为三种限制酶的酶切位点。图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用几种限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含哪种抗生素的培养基上进行？

A、1种  四环素  B、2种  氨苄青霉素   C、1种 四环素     D、2种   四环素

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下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，BAmHI、HinDIII、SmA I直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：

（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用__________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含____________的培养基上进行。能驱动人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控因子是图中的____________。过程①采用的操作方法通常是_____________。

（2）过程②代表的生物技术是_____________。对早期胚胎进行切割，经过程②可获得多个新个体。目前最常见的是经分割产生的同卵______胎。

（3）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用____________技术。

（4）对代孕牛的要求是_________________。

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