发酵面团中含有较为丰富的酵母菌，科研人员从酵母菌中筛选含有高活性淀粉酶的菌株，用于实际生产...

发酵面团中含有较为丰富的酵母菌，科研人员从酵母菌中筛选含有高活性淀粉酶的菌株，用于实际生产。回答下列有关酵母菌分离、纯化的相关问题：

（1）在配制的用于分离高活性淀粉酶的酵母菌的培养基中，除含有水、淀粉、氮源和_______等营养成分外，培养基还需要满足微生物生长对_______________的要求。

（2）纯化酵母菌的关键步骤是_____________，最常用的方法是__________________。

（3）筛选具有高产淀粉酶的酵母菌时，如果菌落周围的培养基上出现___________，则可以判定此处酵母菌产淀粉酶的能力强于其他酵母菌。

（4）分离得到的高活性酵母菌菌株需留一部分进行长期保存，可釆用______________的方法进行保存。

（5）活性淀粉酶的合成场所位于___________。科研人员可以从培养酵母菌的培养液中提取活性淀粉酶，此方法的依据是_______________________。

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淀粉填充聚乙烯类塑料（淀粉—PE）是一种聚乙烯类塑料替代材料，科研人员开展相关研究，从垃圾堆埋场中筛选到能够更高效降解淀粉—PE的菌株。回答下列问题：

（1）科研人员从垃圾堆埋场的土样中筛选分离该菌株的原因是_________。

（2）在进行该菌株的分离筛选时，需将适宜稀释倍数的土壤溶液接种在以_________为碳源的液体培养基上，进行为期5天的富集培养；进一步分离纯化该微生物应采用的接种方法是_________。

（3）研究发现，该菌株能降解淀粉—PE可能是分泌了_________酶和_________酶。研究人员提纯相应的酶需用到凝胶色谱法，该方法是根据_________分离蛋白质。

（4）若要了解相应的酶的最适温度，请设计实验加以探究_________（针对一种酶写出实验思路即可）。

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回答下列（一）、（二）两个小题：

（一）为获得果胶酶，科研人员进行了下列果胶酶高产菌株的分离、筛选、鉴定及果胶酶在生产上的应用试验。

（1）为分离果胶酶产生的某种霉菌，科研人员配制了下表所示成分的培养基，该表中应加入的成分a是_____________，该成分在培养基中的作用为___________________。在各种成分溶解配制好后应将pH调到___________，再进行高压蒸汽灭菌。

（2）将获得的菌株进行扩大培养后，再用_________________（工具）从滤液中获得粗提的果胶酶。如要检测获得的果胶酶活性，可先将等量的果胶酶和果胶混合处理适宜时间，再加入等量的______________，最后根据沉淀物的生成量来判断。

（3）在果汁和果酒制作过程中，常用果胶酶处理来提高相应产品的__________________。生产上通过明胶、海藻酸钠（包埋剂）或戊二醛（交联剂）等对果胶酶进行___________处理，以减少酶的使用量，降低生产成本。

（二）拟南芥中有抗冻基因CBF。苜蓿是温带地区重要的牧草，低温是制约其生长的限制因子之一。下图是培育转基因抗冻苜蓿植株的过程示意图，据图回答下列问题：

（1）图中的①先要用某种限制性核酸内切酶断开DNA片段中的___________个磷酸二酯键得到目的基因，再通过_________________技术获得大量的目的基因。这些目的基因必须要与质粒等载体重组后再导入宿主细胞，其主要原因是目的基因经重组后在宿主细胞内能实现___________（A．转录　 B．复制　　 C．翻译　　 D．整合到宿主DNA中）。

（2）图中的②过程的农杆菌经转化成功后再去感染苜蓿组织块，这种转基因方法的主要优点有______________________________、____________________________（至少写出二点）。

（3）图中的③过程若是通过胚胎发生途径实现，须将愈伤组织经______________培养得到大量的单细胞，再转移到含有适当配比的____________________________的培养基中继续分化成胚状体，最后形成相应的植株。

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谷氨酸是味精的主要成分，常用谷氨酸棒状杆菌发酵生产，但从自然界分离得到的谷氨酸棒状杆菌不耐高糖，且产量不高，科研人员运用有关生物技术手段，使一部分谷氨酸棒状杆菌转化成了耐高糖且产量高的菌株。请回答下列有关问题：

（1）用加______________的培养基可筛选出耐高糖的菌株；如果要检测上述菌株是否被大肠杆菌污染，可在培养基中添加_______________试剂进行鉴别。

（2）生产谷氨酸时，为延长稳定期常采用的方法是________________________；谷氨酸的积累会限制谷氨酸产量的提高，是因为谷氨酸棒状杆菌存在酶__________的调节方式。为提高谷氨酸产量，常用的方法是增大__________的通透性。

（3）生产上接种上述优良菌株前，应先对培养基和发酵设备进行_________处理，目的是______________________________________________。

（4）在生产谷氨酸的过程中，发现谷氨酸棒状杆菌大量繁殖，但是谷氨酸的产量却很低，原因可能是没有及时调整________________________，经技术改进后又检测到代谢产物中有大量的乳酸，其原因很可能是___________________________，可采取的改进措施是__________________________________。

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产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：

（1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是__________（填编号）。

（2）称取1．0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经__________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0．1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌__________个。

（3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行__________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以__________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径__________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。

（4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株__________进行后续相关研究，理由是__________。

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农作物秸秆中含有的纤维素阻碍了堆肥技术在处理有机固体废物领域的发展。为提高堆肥品质：科研人员探究了温度对纤维素分解菌分解能力的影响，实验步骤如下:①纤维素分解菌的筛选、分离及纯化→②纤维素分解菌菌株数量测定→③纤维素酶活力测定和降解滤纸能力的检测。请问答下列问题：

（1）步骤①中，若用稀释涂布平板法接种，则必须将菌液进行一系列的_________，接种所需的培养基中通常加入__________制成固体培养基。已知纤维素酶的最适温度在45～65℃之间，欲从45～65℃的恒温箱中筛选出能高效分解纤维素的细菌，请写出测定纤维素酶的最适温度的实验思路：______________。

（2）步骤②中，在条件适宜的环境下培养细菌10d后，用__________(填一种实验用具）在显微镜下可计算细菌数量。此方法中的“条件”至少包括:适宜温度、以________作为唯一碳源的_______（填“固态”“半固态”或“液态”）培养基等。可用台盼蓝染液鉴定视野中细菌是否死亡，原理是__________。

（3）步骤③中，酶活力可用培养基上菌落直径及_____________来表示。

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农作物秸秆中的纤维素阻碍了堆肥技术在处理有机固体废物领域的发展。为提高堆肥品质，科研人员探究了温度对纤维素分解菌分解能力的影响，实验步骤如下：①纤维素分解菌的筛选、分离及纯化→②纤维素分解菌菌株数量测定→③纤维素酶活力测定和降解滤纸能力的检测。请问答下列问题：

（1）步骤①中，若用稀释涂布平板法接种，则必须将菌液进行一系列的_____。已知纤维素酶的最适温度在45～65℃之间，欲从45～65℃的恒温箱中筛选出能高效分解纤维素的细菌，请写出测定纤维素酶的最适温度的实验思路：_____。

（2）步骤②中，在条件适宜的环境下培养细菌10d后，用_________（填一种实验用具）在显微镜下可计算细菌数量。此方法中的“条件”至少包括：适宜温度、以_________作为唯一碳源的_____（填“固态”“半固态”或“液态”）培养基等。可用台盼蓝染液鉴定视野中细菌是否死亡，原理是_________。

（3）步骤③中，酶活力可用培养基上菌落直径及_____来表示。

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凝乳酶是干酪和干酪素生产过程中的关键酶，动植物及微生物均能产生。由于微生物资源丰富、生长周期短，受气候等因素限制小等特点，微生物凝乳酶成为研究热点。为获得凝乳酶高产菌株，科研人员进行了以下分离、筛选、鉴定工作。

培养基配方表：

（1）从作用上看，该培养基属于______________（填“选择”或“鉴别”）培养基。

（2）科研人员将牧区采集的土壤样品放入无菌水中，振荡混匀，制成悬液。为获得较均匀分布的单菌落，还需要将悬液进行______________，用________________法接种于上述培养基上。接种后的培养基以______________状态放入培养箱。

（3）在涂布接种前，科研人员随机取若干灭菌后的空白平板先进行培养了一段时间，这样做的目的是_____________________________________。

（4）在稀释倍数为106倍下涂布了三个平板（每次取0.1mL），统计菌落数分别为240、250、260，则稀释前1mL菌液中所含此菌数量为_________________。

（5）挑选菌落时以白色沉淀圈大且透明圈小者为佳。将获得的菌株进行液体培养后，从培养液的_____________（填“上清液”或“沉淀物”）获得粗提的凝乳酶。将一定量的粗提凝乳酶与适量酪蛋白溶液混合，一定时间后测定吸光值来测定酶活性。进行吸光值测定时，需将__________与等量酪蛋白溶液混合，作为实验的对照。

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（生物——选修1:生物技术实践）酵母菌是一种单细胞的兼性厌氧真菌，被广泛应用于生产、生活实际中。下面是有关酵母菌的一些问题，请分析回答：

（1）为了进行果酒的发酵生产，通常先分离纯化酵母菌，然后扩大培养、固定化酵母细胞，最后才接种、发酵。

①在分离纯化酵母菌时，需要进行无菌操作，其中对培养皿通常采用_______灭菌。

②在扩大培养时，使用_______(“固体或液体”）培养基培养过程中，并要不断进行振动或者搅拌，目的是______________________。

③固定化酵母细胞常采用_______法，若要使这些酵母反复利用，实验过程中一定要注意________。

④用果汁发酵后检测是否有酒精产生，可以在酸性条件下用________检验，如果出现灰绿色，说明产生了酒精。

（2）在家庭酿制米酒的过程中，需要在混匀酒药的米饭中间挖一个洞，目的是增加______含量，以利于酵母菌繁殖。

（3）经过筛选获得产胡萝卜素的酵母菌R生产胡萝卜素，其大致过程是：培养酵母菌R，进行菌体裂解、离心、沉淀，用________法提取、过滤、浓缩，最后用________法鉴定胡萝卜素。在鉴定过程中，需要用胡萝卜素标准品作为_____________。

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【加试题】回答下列（一）、（二）小题：

（一）请回答与“固定化酶”实验有关的问题：

（1）—淀粉酶可以通过培养枯草杆菌来生产，　　　　 是筛选高表达量菌株的最简便方法之一。筛选出的菌株在发酵生产之前还需利用　　　　　　 培养基进行扩大培养。

（2）利用物理或化学的方法将—淀粉酶固定后，成为　　　　 且又有酶活性的制剂。若用吸附法固定时，在装柱后需要用　　　　　　 缓慢冲洗，直至流出液不使淀粉-碘混合液发生　　　　　　　 为止。

（3）将淀粉溶液以一定流速从反应柱上端滴入，再在下端接取少量流出液进行KI-I2颜色测试，结果不呈现红色。对此现象的解释错误的是

A．反应柱中没有—淀粉酶被固定

B．流速过快淀粉未被水解

C．接取的流出液是蒸馏水

D．流速过慢淀粉被水解成葡萄糖

（二）欲利用基因工程技术将人胰岛素基因转入到小鼠基因组中，以期利用小鼠生产出人胰岛素，请回答：

（1）若用逆转录的方法获得人胰岛素基因，则需要从人体相应的　　　　　　 细胞中提取mRNA，获得的人胰岛素基因经过相应处理后，再利用显微注射技术将其注入到受体细胞中，下列最不适合作为受体细胞的是

（A．受精卵B．胚胎干细胞C．第一次卵裂形成的细胞D．第三次卵裂形成的细胞）

（2）为获得更多的受体细胞，可先对成年雌鼠注射激素进　　　　　　　 处理,将获得的卵母细胞培养成熟，与经　　　　　　 处理的精子结合形成受精卵后再进行后期操作。

（3）导入胰岛素基因的受体细胞还需借助　　　　　　　 、　　　　　　　 等技术才能成为转基因小鼠。

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