图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因...

图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因(抗冻基因)番茄的示意图，外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因，请回答下列问题。

(1)图甲中通常选用质粒C构建重组质粒，而不选用质粒A或质粒B的原因分别是______________________。

(2)据图乙分析，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶________切割目的基因和质粒。

(3)从cDNA文库中获得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)启动子和终止子。

(4)在构建基因表达载体过程中常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在目的基因上游。双启动子的作用可能是________。

(5)为使改造后的AFPs基因能够表达，人工设计质粒D并对它的多个酶切位点进行研究。若用Hind Ⅲ酶或Kpn Ⅰ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166 bp片段。若以HindⅢ酶切割位点为计算起点，则KpnⅠ酶切割位点与Hind Ⅲ酶切割位点最短长度为________bp。

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图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因（抗冻基因）番茄的示意图，外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因，请回答下列问题。

（1）图甲中通常选用质粒C构建重组质粒，而不选用质粒A或质粒B,其中不用质粒A原因是____________________________________。

（2）据图乙分析，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶_____切割目的基因和质粒。

（3）从cDNA文库中获得的目的基因______（填“含有”或“不含有”）启动子和终止子。

（4）在构建基因表达载体过程中常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在目的基因上游。双启动子作用是________________________。

（5）图乙农杆菌中的质粒应含有______，其作用是携带目的基因进入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA。从分子水平检测AFPs基因是否成功表达的方法是_____________。若要获得抗冻能力更强的抗冻番茄，可以对AFPs基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到______工程。

（6）为使改造后的AFPs基因能够表达，人工设计质粒D并对它的多个酶切位点进行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位点为计算起点，则KpnⅠ酶切割位点与HindⅢ酶切割位点最短长度为_______，EcoRⅠ酶的两个切割位点与HindⅢ切割位点的最短距离为_________。

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图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体 质粒 P0 具有四环素 抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoR　 V 酶切位点为，EcoR　 V 酶切出来的线性载体 P1 为__________未端。

（2）用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺 嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________ 的 脱氧核苷酸，形成 P2；P2 和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质 粒 P3。

（3）为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表 中结果判断，应选择的菌落是_____（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、___________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙、丙 3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是____________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一 菌落的质粒中扩增出了 400　 bp 片段，原因是_______________。

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图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：

（1）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。

（2）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________、________________________。

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图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。

（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。

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下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答：

（1）EcoR V酶切P0形成的末端为______末端。

（2）通过PCR扩增获得的目的基因，其两端各自带有一个鸟嘌呤脱氧核苷酸。为了能使载体P1能与目的基因连接，可以用______酶处理，在两端各添加了一个碱基为______的脱氧核苷酸，形成P2。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的培养基进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。结果表明，菌落______是符合要求的。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确的重组质粒中的相应位置。

①引物中A＋T比例越高，PCR过程中退火温度越______。PCR中提供的酶是______。

②某学生用一对引物甲和乙从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，原因是______。PCR过程中需要提供引物的原因是______。

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普通烟草转入抗盐基因培育抗盐烟草的过程如下图所示。已知含抗盐基因的DNA和质粒上均有salⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶切位点，质粒上另有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。请回答问题：

（1）构建重组质粒时，应选用的限制酶是____________，然后对质粒和________进行切割，以保证它们定向连接。

（2）质粒的基本单位是　　　　　　　　　　　　 。

（3）切割后的目的基因与质粒由_______酶连接成重组质粒。筛选导入重组质粒的细菌，应在培养基中加入______________________________，

理由是___________________________________________________________________。

（4）若质粒被某一限制酶识别的序列是一GAATTC一，并在G与A之间切割。请画出被切割后所形成的黏性末端

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（四）生物工程

图1是科学家用转基因（大鼠生长激素基因）方法培育“巨型小鼠”过程中的一个步骤。图2为3种质粒和1个含目的基因的DNA片段，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，都可以作为标记基因。复制原点是质粒上必需的一段复制起始的序列，与重组质粒的自主复制有关。

1.图1表示基因工程中的________（步骤），该步骤采用的技术方法是________。

2.据图2，为构建重组质粒，应使用限制酶________（Pvu Ⅰ / EcoR Ⅰ）进行切割。其中，质粒A、质粒C不能作为此目的基因运载体的原因是________。

3.在分离提纯限制酶EcoR Ⅰ的过程中，能使EcoR Ⅰ沉淀的方法是________。

A. 溶菌酶等酶解细菌细胞壁

B. 超声波、压力等

C. 改变pH或加入硫酸铵

D. 添加稳定剂和填充剂

4.研究人员用交联法固定化EcoR Ⅰ，用戊二醛作为交联剂，使酶交联在一起，限制酶的移动，如图3所示。但发现固定化后的EcoR Ⅰ的活性比未固定化的要低，其最可能的原因是戊二醛________。

A. 增加了酶的分子量

B. 改变了部分酶的活性部位的空间结构

C. 占据了酶的活性部位

D. 分解了部分的酶

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(10分)某质粒上有SalⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示，请回答下列问题。

（1）在构建重组质粒时，应选用　　　　　　　　　　 两种限制酶对　　　　　　　 进行切割，然后进行连接，以保证重组DNA序列的唯一性。（每空2分）

（2）为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，应在培养基中加入　　　　 ，理由是　　　　　　　 。

（3）将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用　　　　　　　　　　 技术，即通过　　　　　　 和　　　　 两个主要过程最终形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加　　　 。

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pBR322是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称，图甲是pBR322结构示意图（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示几种限制酶识别序列及其切割位点。回答下列问题：

（1）质粒是基因工程中常用的工具，其作用是____________________。人工构建pBR322过程中需要的酶是__________________________________________________。

（2）为扩增目的基因可采用PCR技术，该技术利用了_________原理，该技术的前提是需要根据________合成引物。

（3）由图乙可知，经Sau3AⅠ酶切割得到的目的基因可以与被__________酶切割的pBR322连接成重组质粒，原因是____________________。将切割后的目的基因与pBR322质粒混合，加入相应酶反应后，用得到的混合物直接转化处于感受态的大肠杆菌，感受态是指____________________的生理状态。

（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，原因是____________________。

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