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【生物-现代生物科技专题】（10分）
GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 。
（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切。
（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第
泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的
与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
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GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）完成图中A过程必需的工具是 ；该基因治疗的受体细胞为 。
（2）基因工程最核心的步骤是 。
（3）若要构建含GDNF基因的表达载体，则需选择图中的 限制酶进行酶切。
（4）限制酶XhoI和限制酶HpaI的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如下图表示四种质粒,其中,箭头所指部位为酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示GDNF基因运载体的是 。
（5）下列有关限制性核酸内切酶和质粒运载体的描述，正确的是_______。
A．限制性核酸内切酶能识别DNA、切割DNA任一序列
B．限制性核酸内切酶的作用部位与RNA聚合酶的相同
C．使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解
D．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的
（6）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为 个，反向连接的重组载体产生片段有 （多选）。
①100bp ②200bp ③600bp ④700bp ⑤6000bp ⑥6500bp
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GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）完成图中A过程必需的工具是 ；该基因治疗的受体细胞为 。
（2）若要构建含GDNF基因的表达载体，则需选择图中的 限制酶进行酶切。
（3）限制酶XhoI和限制酶HpaI的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如下图表示四种质粒,其中,箭头所指部位为酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示GDNF基因运载体的是 。
（4）下列有关限制性核酸内切酶和质粒运载体的描述，错误的是_______（多选）。
A．限制性核酸内切酶能识别DNA、切割DNA任一序列
B．限制性核酸内切酶的作用部位与RNA聚合酶的相同
C．使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解
D．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的
（5）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为 个，反向连接的重组载体产生片段有 （多选）。
①100bp ②200bp ③600bp ④700bp ⑤6000bp ⑥6500bp
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GDNF是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究．请回答：
（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 ．
（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切．
（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）．为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示．图中第 泳道显示所鉴定的载体是正向连接的．
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的 与提取的蛋白质杂交．当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验．
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GDNF是一种神经营养因子，研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），经筛选得到的载体主要有三种。为鉴定这3种连接方式，选择限制性核酸内切酶对筛选的载体进行酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。若图2中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的，则鉴定时所选的限制性核酸内切酶是（ ）
A.XhoI B.HpaI和BamHI C.HpaI和XhoI D.BamHI和XhoI
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GDNF是一种神经营养因子，研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），经筛选得到的载体主要有三种。为鉴定这3种连接方式，选择限制性核酸内切酶对筛选的载体进行酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。若图2中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的，则鉴定时所选的限制性核酸内切酶是（ ）
A.XhoI B.HpaI和BamHI C.HpaI和XhoI D.BamHI和XhoI
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胶质细胞分泌的神经营养因子（GDNF）对神经元有保护和修复作用。为研究高尔基体膜分选受体S对GDNF分泌的影响，研究者进行了实验。
（1）分泌蛋白一般通过两种途径被分泌到胞外：一种是不受外界影响持续的组成型分泌，另一种是受到生理刺激后产生的调节型分泌，如下图。
分泌蛋白的分泌过程与膜的________有关。M作为信号分子的________，其加工过程发生在________。
（2）研究者将受体S基因与GDNF基因均转入PC12细胞，构建了S基因过量表达的细胞系甲，并和仅转入GDNF基因的PC12细胞系乙进行比较，检测结果如下图。
据图可知，受体S对GDNF分泌的影响是________________。
（3）为验证上述结论，研究者将与S基因序列互补的小RNA（抑制S基因表达）导入到上述细胞系________中作为实验组，对照组导入________的RNA。与对照组相比，若实验组细胞的GDNF的调节型分泌量________，组成型分泌量________，则证明上述结论正确。
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鸡干抗素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①-④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_____________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了______________和_____________序列，以便于后续的剪切和连接。
(2)步骤②所构建的基因表达载体中末标注出的必需元件还有_______________________，步骤③中需先用__________________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再通过PCR扩增制备探针，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是_________________________。
(4)用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数(植物受病毒侵染的严重程度)为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79，说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有_______________________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了________和________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有________个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列_______(相同/不相同)
(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，步骤③中需先用________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是________________。
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鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
（1）表格中的限制酶EcoRⅠ切割DNA分子后形成的黏性末端是_________________。
（2）步骤①是利用PCR技术扩增鸡干扰素基因，进行PCR的前提是___________。
（3）图中选用两种限制酶分别处理鸡干扰素基因和农杆菌Ti质粒，这样做的优点有_________。
（4）步骤②所构建的基因表达载体中启动子的作用是 ____________。
（5）步骤③中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
（6）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再通过PCR扩增制备探针，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________________。