下列有关多聚酶链式反应（PCR）扩增目的基因的叙述，错误的是A.为方便构建重组质粒，在引物...

下列有关多聚酶链式反应（PCR）扩增目的基因的叙述，错误的是（　　 ）

A.为方便构建重组质粒，在引物中需要适当添加限制酶的切割位点

B.PCR扩增时，复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关

C.PCR扩增一般需要经历多个循环，每个循环分为变性、复性和延伸3步

D.PCR扩增后，常用离心法分离扩增的DNA分子，以便于鉴定产物的存在和大小

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金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______获得______用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______位点。设计引物时需要避免引物之间形成______，而造成引物自连。

（3）图中步骤1代表______，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。若要将1个目的基因复制10 次，则需要在缓冲液中至少加入______个引物。 从理论上推测，第四轮产物中含有引物1的DNA片段所占的比例为______。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏______的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但______的引物需要设定更高的退火温度。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有______（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）．

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下列有关基因工程技术的叙述，正确的是

A.不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同

B.PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关

C.在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体

D.质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上并表达

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多聚酶链式反应（PCR）一次循环：95℃下使模板 DNA 变性、解链→55℃下复性（引物与 DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关 PCR 过程的叙述中错误的是（ ）

A.变性过程未加解旋酶，是因为可以通过先适当加温来破坏 DNA 碱基对中氢键

B.PCR 技术扩增需要的条件是目的基因、引物、四种脱氧核苷酸、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶

C.PCR 技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等

D.如果反应体系中加入模板 DNA100 个，则经过 30 个循环后，DNA 的数量为 100×230 个

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基因工程重要环节是构建基因表达载体。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列和切割位点，图2表示DNA片段，图3表示目的基因及限制酶切点，图4表示质粒。请回答下列问题：

（1）若图2就是图1中的最左边显示的三个碱基对，则④⑤⑥⑦⑧⑨对应的碱基依次是________。限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，切开的位置是图2中编号为______位置的________键。

（2）已知DNA复制子链的延伸方向是5′→3′，图3中的A、B、C、D在不同情况下可以作为引物，在PCR技术中，扩增此目的基因，应该选用________两个作为引物。

（3）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用____________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过______________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入经____________处理过的_____________态的大肠杆菌中。

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乳头瘤病毒（HPV，为DNA病毒）可导致人患宫颈癌，科研人员将HPV某外壳蛋白A基因构建成表达载体，经包装或直接注入体内，表达出相应抗原，诱导机体产生免疫反应。该方法获得的疫苗称为DNA疫苗。请回答下列问题：

（1）获取A基因的方法：

①方法一：提取HPV的DNA，利用PCR技术扩增A基因。PCR技术的前提是：____________，以便合成引物。PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但___________的引物需要设定更高的退火温度。如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____（填序号：①升高退火温度　 ②降低退火温度　 ③重新设计引物）。

②方法二：从宿主细胞中提取总RNA，以与__________________互补的一段单链DNA作为引物，加入___________酶获得cDNA，然后经PCR扩增获得大量的A基因。

（2）在基因工程的基本操作程序中，利用PCR技术扩增目的基因后，需要进行_____________，其目的是__________。该过程中常用不同的限制酶切割质粒与目的基因，其具备的优势是___________________。

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小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。下列相关叙述不正确的是（　　 ）

A.设计扩增目的基因的引物时必须与表达载体的序列相配对

B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列

C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶

D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞

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目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于___________________。

（2）对目的基因进行扩增的常用方法是PCR，该技术所依据的原理是__________________，PCR扩增某目的基因时需要引物___________种，扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中______过程的温度设定是扩增成败的关键。PCR中用到的酶为 _____________ 酶。

（3）若用噬菌体替代质粒作为运载体构建基因表达载体的过程中，是否需要利用CaCl2处理大肠杆菌，制备感受态细胞_______（需要　 不需要） ，原因是_______________ 。

（4）用BamHI处理目的基因和质粒后用DNA连接酶连接获得重组质粒，为了检测该重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布放到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布放到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是 _____________________________图三结果显示，少数大肠杆菌导入的是 ______________ 。

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下图表示通过cDNA过程获得目的基因并利用PCR扩增过程的示意图。据图分析，下列有关叙述错误的是(　　)

A. 催化①过程的酶是RNA聚合酶

B. ③过程不需要DNA解旋酶

C. ④过程需要两个相同的引物

D. 催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，均须耐高温

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重组人血小板生成素（rhTPO）是一种造血生长因子，如图是科学家培育乳汁中含有rhTPO的羊的相关过程。请回答下列相关问题。

（1）利用PCR技术对目的基因进行扩增时，利用的原理是__________。设计引物是PCR技术的关键之一，某同学根据已知的rhTPO基因的核苷酸序列设计的两对引物如下图所示，其中引物对__________（填“A”或“B”）设计不合理，原因是__________。

（2）HindIII和XhoI两种限制酶切割出的黏性末端不同，将含有rhTPO基因的DNA片段和质粒都通过HindIII和XhoI切割，可以避免__________。拼接成重组质粒时，需要加入__________酶才能完成。rhTPO基因能否在羊受精卵细胞中稳定遗传的关键是__________。

（3）通常需要在胚胎移植前对早期胚胎进行性别鉴定，应从发育到__________时期的胚胎的__________中取样做DNA分析性别鉴定。

（4）为了使rhTPO基因只在羊乳腺细胞中表达，在构建基因表达载体时需要在rhTPO基因前端加上__________。移植的胚胎可以在受体母羊中存活的原因是__________。

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