下图为希望导入植物细胞的重组DNA分子，箭头代表PCR扩增时子代DNA的延伸方向，T- D...

下图为希望导入植物细胞的重组DNA分子，箭头代表PCR扩增时子代DNA的延伸方向，T- DNA片段基因序列已知，设计四段T- DNA的引物A、B、C、D，若利用PCR技术扩增T- DNA片段和未知基因片段，可选择作为引物的分别是

A.A、D， B、C

B.A、B， C、D

C.B、D，A、C

D.C、D，A、B

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禾谷镰刀菌可侵染小麦等作物，使其产量和品质下降。研究者通过构建融合基因 Ve-FG 并转化拟南芥，以期实现转基因植物抗禾谷镰刀菌的目的。

（1）利用 PCR 技术，将野生番茄的抗黄萎病基因 Ve 与禾谷镰刀菌的识别基因 FG 进行重组，构建融合基因 Ve-FG（如图 1）。

① 设计 3 对引物。其中引物 2 的一部分序列与 C 片段一部分序列互补，另一部分序列与_____片段一部分序列互补。

② 通过 PCR 分别克隆A、C、P 片段。克隆 A 片段应选用的引物是_____。

③ 以 A、C、P 片段为_____进行延伸，将 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 进行 PCR，扩增融合基因 Ve-FG。

（2）用_____将 Ve-FG 与质粒连接，构建重组质粒（如图 2，图中潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达）。将农杆菌与重组质粒混合，一段时间后涂布到含有_____的平板培养基上进行筛选。用含重组质粒的农杆菌转化拟南芥，几周后收获种子，种在含有潮霉素的培养基上，获得转基因拟南芥株系 1 和株系 2。

（3）分别提取株系 1 和 2、非转基因拟南芥植株叶片中的 DNA 作为模板，PCR 扩增 Ve-FG 基因后进行电泳，结果如图 3。

① 电泳时应以_____为阳性对照。

② 成功导入 Ve-FG 基因的是_____。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但电泳结果无阳性条带，原因可能是_____。

（4）为检验融合基因 Ve-FG 的功能，以导入 Ve-FG 基因的植株为实验组，导入空白质粒的植株为对照组，分别接种_____。一段时间后观察发现，与对照植株相比，实验组整体长势更旺盛，叶片萎蔫程度、叶片变黄程度也较轻，这表明_____。

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农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增岀T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是（　　 ）

注：子链从引物的3/端开始延伸

A.PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理

B.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定DNA聚合酶

C.利用图中的引物②、③组合可扩增岀两侧的未知序列

D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置

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利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（　　 ）

A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列

B.设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连

C.退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物

D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16

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金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______获得______用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______位点。设计引物时需要避免引物之间形成______，而造成引物自连。

（3）图中步骤1代表______，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。若要将1个目的基因复制10 次，则需要在缓冲液中至少加入______个引物。 从理论上推测，第四轮产物中含有引物1的DNA片段所占的比例为______。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏______的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但______的引物需要设定更高的退火温度。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有______（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）．

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利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础，下列叙述错误的是（　　 ）

A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列

B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连

C.退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物

D.第三轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为5/8

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科学家研究表明，新冠病毒是蛋白质包裹的单链 RNA 病毒，通过刺突蛋白（S 蛋白）与人的 ACE2 受体识别结合，来感染人的呼吸道上皮细胞。请回答下列问题：

（1）获取病毒 RNA 后，采用_____法得到其cDNA，再利用 PCR 技术扩增S 蛋白基因，扩增时用到的酶有_________。

（2）科学家利用S 蛋白作为抗原，刺激实验动物的免疫系统，以获取_____，用 于新冠病毒的检测及筛查。

（3）将重组质粒导入受体细胞后，首先要检测______， 这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。检测的方法是 DNA 分子杂交技术， 即在含有目的基因的片段上用_____等做标记，以此作为探针来检测。

（4）用荧光探针检测目的基因时，先将探针与染色体共同煮沸，使 DNA 双链中_________________断裂，形成单链。随后在降温复性过程中，探针的碱基依据_____原则， 与受体细胞中特定基因序列形成较稳定的杂交分子。

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由腊梅凝集素基因控制合成的某种蛋白质能与蚜虫肠道黏膜上的受体结合，从而抑制蚜虫吸收营养物质。通过基因工程将腊梅凝集素基因转入烟草，可增强其抗蚜虫的能力。请回答下列问题：

（1）以腊梅凝集素基因产生的mRNA作为模板，在_______________酶的作用下，按照_______________原则获得cDNA片段，以获取目的基因。

（2）为增加目的基因的数目，可用PCR技术进行扩增。PCR扩增之前，需要设计一对与目的基因两端序列互补配对的引物，若根据腊梅凝集素基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是_______________。

（3）在PCR反应体系中，除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外，还应有_______________。

（4）将目的基因导入烟草细胞常用的方法是农杆菌转化法。农杆菌的Ti质粒上的T-DNA具有________________________的特点。在该过程中需要添加酚类物质，目的是________________________。

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利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，且需要提供引物，引物是子链合成延伸的基础，下列叙述不正确的是（　　 ）

A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列

B.设计引物时需要避免引物间的碱基互补配对而造成引物自连

C.退火温度过高可能会导致PCR中得不到任何扩增产物

D.第四轮循环产物中同时含有两种引物的DNA片段所占的比例为15/16

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PCR技术是模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种其形成过程如下图所示。请回答下列问题：

（1）DNA分子具有方向性，通常将其羟基末端称为3端磷酸基团末端称为5端。DNA复制时子链延伸的方向是__________（填“5′→3′”或“3′→5′”）。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为___________。

（2）如果扩增序列为下图所示的两段序列之间的DNA片段请从下表列出的引物中选出一对合适的引物___________。

5′- GACCTGTGGAAGC…… CATACGGGATTG-3′

3′- CTGGACACCTTCG…… GTATGCCCTAAC-5′

（3）下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤请完善相关步骤内容。

a．按配方准备好各组分。

b．用微量移液器向微量离心管中依次加人各组分：模板DNA4种脱氧核苷三磷酸、_______、引物、缓冲液等。

c．__________使反应液集中在微量离心管底部。

d．将微量离心管放入PCR仪设计好PCR仪的循环程序。

e．进行PCR反应。

（4）PCR的产物片段中，只有______________才是符合要求的目标产物。若将一个源DNA进行PCR反应，从理论上推测第30轮循环产物中不符合要求的DNA片段有___________个。

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