如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA...

如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindDI在质粒上 的识别位点如乙图所示。

（1）通过PCR技术扩增目的基因需使用引物，引物的作用是_________。若已经合成了甲图所示4种引物，应选择引物_____扩增目的 基因。若由一条甲图所示的DNA扩增目的基因，PCR过程完成4轮循环，理论上至少 需加入引物___________个。

（2）过程①是_________，该过程中应使用限制酶_________切割质粒。不使用另外两种限制酶切割质粒的原因是_________。

（3）②过程需用_________处理大肠杆菌使其处于感受态并完成转化过程，对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行_________处理，以防其污染环境。

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人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可通过转基因技术在羊乳中获得。流程如下：

（1）上述基因工程中，目的基因是_______；在重组表达载体中有一段特殊的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，这段DNA被称为_____。基因工程所用DNA连接酶有两类，其中只能连接黏性末端的是________DNA连接酶。

（2）常采用PCR技术扩增目的基因，在此过程中，由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能从_____端延伸DNA单链，因此需要加入引物。

（3）成熟的基因表达载体除了含有目的基因外，还必须有启动子、终止子以及________________等。

（4）如果将基因表达载体导入大肠杆菌时，一般要用_________处理该菌，使之成为_____________细胞，以便吸收周围环境中的DNA分子。

（5）科研人员通过_____法，将基因表达载体导入猪的受精卵中。可通过______技术，来检测目的基因是否已导入到猪受精卵细胞的DNA分子上。

（6）在操作中要对供体母羊注射__________进行超数排卵处理；应采用____________法使精子体外获能；对供体母羊和__________进行同期发情处理。该转基因母羊进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产htPA，因而被称为________________。

（7）为了获得含有htPA的羊乳，在移植前取早期胚胎滋养层细胞进行_____________。

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下列关于基因工程的叙述，错误的是（　　 ）

A.可用农杆菌转化法将目的基因导入大豆受体细胞

B.不同限制酶切出的黏性末端也可能连接在一起

C.T4DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端也可以“缝合”平末端

D.目的基因都必须含有启动子和终止子

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目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于___________________。

（2）对目的基因进行扩增的常用方法是PCR，该技术所依据的原理是__________________，PCR扩增某目的基因时需要引物___________种，扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中______过程的温度设定是扩增成败的关键。PCR中用到的酶为 _____________ 酶。

（3）若用噬菌体替代质粒作为运载体构建基因表达载体的过程中，是否需要利用CaCl2处理大肠杆菌，制备感受态细胞_______（需要　 不需要） ，原因是_______________ 。

（4）用BamHI处理目的基因和质粒后用DNA连接酶连接获得重组质粒，为了检测该重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布放到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布放到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是 _____________________________图三结果显示，少数大肠杆菌导入的是 ______________ 。

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玉米是世界上的第三大粮食作物，广泛种植于世界各地。研究表明，转基因抗虫玉米中的细菌BT基因能表达一种毒蛋白，这种毒蛋白能有效杀死玉米螟（一种农业害虫）。请回答下列问题：

（1）BT基因在基因工程中称为_________。在基因表达载体中，除了要有BT基因外，还必须有启动子、终止子和______。若将BT基因插入到Ti质粒的_________上，通过农杆菌的转化作用，就可以使其导入玉米细胞并将其插入到玉米细胞中的染色体上。

（2）PCR是利用__________ 的原理，在利用PCR技术扩增BT基因时，需要提供模板、原料、引物、______等条件，将模板DNA加热至90〜95℃ 的目的是__________。

（3）BT基因与载体结合过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。若某限制酶的识别序列和切点是，请画出目的基因被限制酶切割后所形成的黏性末端_______。DNA连接酶对所连接的两端碱基序列__________(填“有”或“没有”）专一性要求，定性地检测BT基因的“表达”产物可采用____________________的方法。

（4）为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题，科研小组考虑将抗虫基因导入到玉米根尖细胞的__________中以防止基因污染，同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个避难所种植普通玉米，目的是_______________。

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基因工程重要环节是构建基因表达载体。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列和切割位点，图2表示DNA片段，图3表示目的基因及限制酶切点，图4表示质粒。请回答下列问题：

（1）若图2就是图1中的最左边显示的三个碱基对，则④⑤⑥⑦⑧⑨对应的碱基依次是________。限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，切开的位置是图2中编号为______位置的________键。

（2）已知DNA复制子链的延伸方向是5′→3′，图3中的A、B、C、D在不同情况下可以作为引物，在PCR技术中，扩增此目的基因，应该选用________两个作为引物。

（3）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用____________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过______________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入经____________处理过的_____________态的大肠杆菌中。

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用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的胰岛素。下列叙述不正确的是　　　　　 （　　 ）

A.导入大肠杆菌的目的基因不一定成功表达

B.常用相同的限制酶处理目的基因和质粒

C.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶

D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒

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下列关于基因工程的叙述中，错误的是

A．基因工程常用的运载体包括细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒

B．将目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是用Ca2+处理细胞

C.基因工程中的工具酶有限制酶和DNA连接酶

D．基因治疗是把有基因缺陷的细胞中的缺陷基因剔除后再导入健康的外源基因

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下列关于基因工程的叙述中，错误的是

A.基因工程常用的运载体包括细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒

B.将目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是用Ca2+处理细胞

C.基因工程中的工具酶有限制酶和DNA连接酶

D.基因治疗是把有基因缺陷的细胞中的缺陷基因剔除后再导入健康的外源基因

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用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质，下列叙述不正确的是    (　　)

A.常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒

B.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶

C. 将目的基因导入受体细胞需要运载体

D.导入大肠杆菌的目的基因不一定成功表达

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