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人内皮抑制素（HES）是血管形成抑制因子，具有抗肿瘤的作用，可在转HES基因母羊的羊乳中获得。图13表示含有HES基因的DNA片段，图14表示pZHZ11质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ4种限制酶识别的碱基序列和切割位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、G↓AATTC、CCC↓GGG。
将重组质粒导入受体细胞，采用体细胞克隆技术获得转HES基因绵羊，技术流程如图15所示。
1.HES基因的获得可以从人的胎盘细胞中提取____________，通过逆转录方法合成含HES基因的DNA片段。若将HES基因和图中的质粒连接形成重组质粒，那么应选用_____________限制酶切割，而后加入__________酶连接。
2.该技术流程中，重组质粒的受体细胞是______________，所涉及的生物工程技术有_______________（填编号）。
①动物细胞培养技术 ②细胞核移植技术 ③干细胞技术 ④转基因技术
⑤动物细胞融合技术
3.若在母羊D的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。
4.为深入研究HES的作用机制，需要用杂交瘤技术来获得单克隆抗体。单克隆抗体制备的依据是_________
A. B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖
B. B淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体
C. 骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体
D. 骨髓瘤细胞既可以产生抗体，又能无限增殖
5.若将图15中早期胚胎中的干细胞在一定条件下，诱导分化形成的组织器官移植给图中母羊_________（填“A. B. C或D”，则不会发生免疫排斥反应。
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人的内皮抑素（一种蛋白质）能诱导血管内皮细胞凋亡，进而抑制新血管的产生。临床上通过静脉注射含有内皮抑素基因的腺病毒感染肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生并释放内皮抑素，抑制新生血管的形成，使肿瘤细胞进人休眠状态并诱导其凋亡。
回答下列问题：
（1）从肝细胞中提取总mRNA,利用逆转录酶合成 ，根据内皮抑素基因的 设计并合成引物，利用PCR技术得到大量内皮抑素基因。
（2）在构建含内皮抑素基因的腺病毒并导人受体细胞的过程中，以 作为工具酶，以 作为载体。
（3）在进入临床使用前，需用体外培养的血管内皮细胞进行生理、病理检测。为获得大量的血管内皮细胞，首先用 酶处理血管内皮组织，使其分散成单个细胞，制成细胞悬液，然后将其放人含 等一些天然成分的合成培养基中培养。
（4）血管内皮细胞被重组腺病毒感染后，若通过 方法检测呈阳性并观察到细胞凋亡，则说明内皮抑素基因得到表达且具有生物学活性。
（5）临床上将含内皮抑素基因的腺病毒通过静脉注射感染肿瘤细胞，使肿瘤生长受到抑制，这种治疗方法属于 （填“体内”或“体外”）基因治疗。
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【生物-选修3：现代生物科技专题】人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得，流程如图1。图2位含有目的基因的DNA片段及其具有的限制酶切点，表格中是4种限制酶的识别序列和酶切位点，请据图表回答下列问题：
| 限制酶 | MspI | BamHI | MboI | SmaI |
| 识别序列及切点 | CICGG | GIGATCC | IGATC | CCCICGG |
（1）若需利用酶切法获得目的基因，最好应选择的限制酶是_____。
（2）图I中序号1代表的是________________，它是_____________的部位。
（3）为获取更多的卵（母）细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其__________。精子和卵子在体外受精后，应将受精卵移入_____________中继续培养。
（4）若要获得多个转基因个体应选择_____________的桑葚胚或囊胚进行胚胎分割。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________________。
（5）人们对转基因生物的安全性的争论主要有：食物安全、_____________安全和环境安全三个方面的激烈争论。
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［生物—选修3现代生物科技专题
人的内皮抑素（一种蛋白质）能诱导血管内皮细胞凋亡，进而抑制新血管的产生。临床上通过静脉注射含有内皮抑素基因的腺病毒感染肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生并释放内皮抑素，抑制新生血管的形成，使肿瘤细胞进人休眠状态并诱导其凋亡。回答下列问题：
（1）从肝细胞中提取总mRNA,利用逆转录酶合成 ，根据内皮抑素基因的 设计并合成引物，利用PCR技术得到大量内皮抑素基因。
（2）在构建含内皮抑素基因的腺病毒并导人受体细胞的过程中，以 作为工具酶，以 作为载体。
（3）在进入临床使用前，需用体外培养的血管内皮细胞进行生理、病理检测。为获得大量的血管内皮细胞，首先用 酶处理血管内皮组织，使其分散成单个细胞，制成细胞悬液，然后将其放人含 等一些天然成分的合成培养基中培养。
（4）血管内皮细胞被重组腺病毒感染后，若通过 方法检测呈阳性并观察到细胞凋亡，则说明内皮抑素基因得到表达且具有生物学活性。
（5）临床上将含内皮抑素基因的腺病毒通过静脉注射感染肿瘤细胞，使肿瘤生长受到抑制，这种治疗方法属于 （填“体内”或“体外”）基因治疗。
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内皮抑素是从血管内皮细胞瘤中分离出的一种内源性血管生成抑制因子，能特异性地抑制内皮细胞增殖和迁移。某小组为获得内皮抑素，构建分泌型内皮抑素基因表达载体，并在C6细胞（大鼠源性胶质瘤细胞）中表达。具体操作如下：
（1）构建分泌型内皮抑素基因表达载体
①采用相关技术提取1日龄SD大鼠大脑半球组织中的总RNA，检测RNA质量和浓度。
②内皮抑素cDNA的获得：以上述提取的RNA为模板，通过________过程获得cDNA，并利用PCR技术体外扩增cDNA。PCR技术中除需目的基因作为模板外，还需要的条件有________和控制温度等。
③为避免目的基因和载体自身环化，酶切目的基因和载体时，可用________酶切割，以保证目的基因两侧和载体上具有________。
（2）目的基因在C6细胞中表达（将目的基因导入C6细胞中，并表达）
①培养C6细胞时，为防止杂菌污染，可在培养基中加入一定量的________。
②若要检测目的基因是否成功整合到受体细胞的DNA上，可采用________技术。
③导入C6细胞中的目的基因成功表达后，会使C6细胞在大鼠体内的________可能会受到抑制。
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肿瘤的生长依赖于新生血管，血管内皮生长因子(VEGF)是目前公认最关键的促血管形成因子。为研究促性腺激素释放激素(GnRH)类似物(药物甲)、“顺铂”(一种化疗药物乙)及其联合作用对卵巢癌动物血管生成的影响，研究人员以卵巢癌细胞为研究对象，检测细胞中血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质的含量。
材料与用具：3 mg/L顺铂、10－7 mol·L－1 GnRH类似物、胰蛋白酶、12孔细胞培养板(每个孔可进行细胞培养)、卵巢癌细胞、细胞培养液、CO2培养箱。
(要求与说明：不考虑加入顺铂和GnRH类似物对体积的影响；VEGF的mRNA和蛋白质含量的具体检测步骤不作要求；实验条件适宜)
(1)实验思路：(其中药物加入设计画在下面的12孔细胞培养板示意图中即可，无需再文字说明；药物可用甲、乙表示；药物作用3天，每24 h检测一次，无需前测；重复实验不要求)
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(2)若GnRH类似物、顺铂都能抑制血管生成，且联合作用效果更佳。请画出药物作用48 h时血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质相对含量的柱形图。
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(3)实验分析：
①促性腺激素释放激素由________产生。
②如果已得到上述第(2)小题中的实验结果，为了进一步在活体水平上验证这两种药物及其联合作用的影响，下一步你将选用身体状况一致的________动物，随机均分后，分组进行药物处理，观察__________。
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【加试题】肿瘤的生长依赖于新生血管，血管内皮生长因子（VEGF)是目前公认最关键的促血管形成因子。为研究促性腺激素释放激素（GnRH)类似物（药物甲）、“顺铂”（一种化疗药物乙)及其联合作用对卵巢癌动物血管生成的影响，研究人员以卵巢癌细胞为研究对象，检测细胞中血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质的含量。
材料：3mg/L顺铂、10-7mol/LGnRH类似物、胰蛋白酶、12孔细胞培养板（每个孔可进行细胞培养）、卵巢癌细胞、细胞培养液、C02培养箱
(要求与说明：不考虑加入顺铂和GnRH类似物对体积的影响；VEGF的mRNA和蛋白质含量的具体检測步骤不要求；实验条件适宜）
(1)实验思路（其中药物加入设计画在下面的12孔细胞培养板示意图中即可，无需再文字说明；药物可用甲、乙表示；药物作用3天，每24h检测一次，无需前测；重复实验不要求）_________
(2)若GnRH类似物、顺铂都能抑制血管生成，且联合作用效果更佳。请画出药物作用48h时血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质相对含量的柱形图。
_________
(3)实验分析：
①促性腺激素释放激素由_________产生。
②如果已得到上述第（2)小题中的实验结果，为了进一步在活体水平上验证这两种药物及其联合作用的影响，下一步你将选用身体状况一致的______动物,随机均分后，分组进行药物处理，观察________。
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血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的诱导肿瘤血管生成的最强烈的血锌生成因子，针对VEGF生产的抗肿瘤药物，是治疗癌症的一个方向；芝加哥大学的Katherine Knight博士成功地在转基因兔中获得骨髄瘤样肿瘤，经技术改进，能高产量地生产兔单克隆抗体：我国江苏省某公司首次在全球成功开发出人源化兔单抗药物“注射用人源化抗VEGF单克隆抗体”（SIM63）,有效打破了跨国公司的技术垄断。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。请回答下列相关问题：
（1）动物细胞在体外培养的技术属于 工程，由于人们对动物细胞所需的营养物质没有完全搞淸楚，在使用合成培养基时，通常需要加入 等一些天然成分：在培养时除提供细胞所需的O2外，还需要CO2，其作用是 。
（2）在基因工程中，将目的基因导入动物细胞现今极常用、极有效的方法是 ，要在短时间内扩增大量的目的基因采用 技术，这个技术中的关键酶是 。
（3）当VEGF作为抗原进入动物体内时，动物体内的某些B细胞分化为浆细胞，这种浆细胞只分泌针对VEGF的一种抗体，但B细胞在体外培养不会无限增殖，解决这一问题的方法是通过动物细胞融合技术得到杂交瘤细胞，常用的化学诱导融合试剂为 ，要分离出杂交瘤细胞,应该用 培养基进行筛选，单克隆抗体最主要的优点是它的 ,并可大量制备。
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血管内皮生长因子（VEGF）是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。
研究人员利用pVAX1质粒和VEGF基因构建了PVAX1—VEGF的DNA疫苗，为肿瘤免疫治疗奠定基础。回答下列问题：
（1）首先从人的肺癌细胞株A549中提取mRNA，通过_______法获得VEGF基因。
（2）对获取的VEGF基因进行PCR扩增前，需要根据VEGF基因序列设计两种引物，其原因是_________。为便于VEGF基因与质粒pVAX1连接，引物中要增加适当的__________。扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中______过程的温度设定是扩增成败的关键。
（3）构建的PVAX1—VEGF上应含有特定的______（填“复制原点”或“启动子”或“标记基因”），它能被受体细胞的_______所识别，以便于催化转录过程。
（4）DNA疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是________________。
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人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：
（1）卵母细胞可以从活体 中采集，还可以从已处死的雌羊卵巢中获取。对供体母羊用
处理，才具备受精能力。
（2）欲用有限的早期胚胎获得多个转基因个体，可以利用 技术。由于代孕母羊对移入其子宫的外来胚胎 ，才使早期胚胎能再代孕母羊体内存活。
（3）质粒上应有 ，才能使htPA基因插入其中。在转htPA基因母羊的肌肉细胞中 （能、不能）检测到目的基因。若在其羊乳中检测到 ，说明目的基因成功表达。