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内皮抑素是从血管内皮细胞瘤中分离出的一种内源性血管生成抑制因子，能特异性地抑制内皮细胞增殖和迁移。某小组为获得内皮抑素，构建分泌型内皮抑素基因表达载体，并在C6细胞（大鼠源性胶质瘤细胞）中表达。具体操作如下：
（1）构建分泌型内皮抑素基因表达载体
①采用相关技术提取1日龄SD大鼠大脑半球组织中的总RNA，检测RNA质量和浓度。
②内皮抑素cDNA的获得：以上述提取的RNA为模板，通过________过程获得cDNA，并利用PCR技术体外扩增cDNA。PCR技术中除需目的基因作为模板外，还需要的条件有________和控制温度等。
③为避免目的基因和载体自身环化，酶切目的基因和载体时，可用________酶切割，以保证目的基因两侧和载体上具有________。
（2）目的基因在C6细胞中表达（将目的基因导入C6细胞中，并表达）
①培养C6细胞时，为防止杂菌污染，可在培养基中加入一定量的________。
②若要检测目的基因是否成功整合到受体细胞的DNA上，可采用________技术。
③导入C6细胞中的目的基因成功表达后，会使C6细胞在大鼠体内的________可能会受到抑制。
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研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。
（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经________获得内皮抑素基因，再经________进行扩增，以获得更多的目的基因。
（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有________和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成________颜色的菌落，原因是__________________。
（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
粗提表达产物浓度/(μg·mL－1)
0
2
4
6
8
10
活的内皮细胞数目(×102)
12
6
2
1
0.5
0.5
实验结果说明_____________________________________________________
_____________________________________________________________。
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(10分）研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂一内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题：
(1) 从肝细胞中分离总RNA，经_________获得cDNA，之后经过_________扩增内皮抑素基因。
(2) 扩增的目的基因与PUC18质粒（如图14所示）都用EcoR I和BamH I进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了________的连接，提高了重组质粒的比例。
(3) 大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入_______物质。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成______________颜色的菌落，原因是_____________________。之所以选择大肠杆菌作为基因工程的受体菌，其突出的优点是：___________________________________
(4) 从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，370C培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72h后在显微镜下观察细胞存活情况并，______________实验结果如下表所示。
结果说明__________________________________________
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人内皮抑制素（HES）是血管形成抑制因子，具有抗肿瘤的作用，可在转HES基因母羊的羊乳中获得。图13表示含有HES基因的DNA片段，图14表示pZHZ11质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ4种限制酶识别的碱基序列和切割位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、G↓AATTC、CCC↓GGG。
将重组质粒导入受体细胞，采用体细胞克隆技术获得转HES基因绵羊，技术流程如图15所示。
1.HES基因的获得可以从人的胎盘细胞中提取____________，通过逆转录方法合成含HES基因的DNA片段。若将HES基因和图中的质粒连接形成重组质粒，那么应选用_____________限制酶切割，而后加入__________酶连接。
2.该技术流程中，重组质粒的受体细胞是______________，所涉及的生物工程技术有_______________（填编号）。
①动物细胞培养技术 ②细胞核移植技术 ③干细胞技术 ④转基因技术
⑤动物细胞融合技术
3.若在母羊D的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。
4.为深入研究HES的作用机制，需要用杂交瘤技术来获得单克隆抗体。单克隆抗体制备的依据是_________
A. B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖
B. B淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体
C. 骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体
D. 骨髓瘤细胞既可以产生抗体，又能无限增殖
5.若将图15中早期胚胎中的干细胞在一定条件下，诱导分化形成的组织器官移植给图中母羊_________（填“A. B. C或D”，则不会发生免疫排斥反应。
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科学研究发现，低氧诱导因子广泛存在于慢性缺氧细胞中，它可以通过调节促红细胞生成素基因的表达，诱导血管内皮细胞生成因子的增加，从而促进血管和红细胞生成。而新生成的毛细血管能进入肿瘤内部为癌细胞提供养料使癌症恶化。下列相关叙述正确的是（ ）
A.促进低氧诱导因子的降解可能会抑制癌细胞的生长
B.氧气充足有利于促红细胞生成素基因的表达
C.抑制低氧诱导因子的功能会改善贫血症状
D.心肌细胞生命活动旺盛，因而不会存在低氧诱导因子
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下图为巨噬细胞炎症反应的新机制研究，巨噬细胞受细菌感染或细菌脂多糖 LPS刺激后，升高血管内皮生长因子受体3（ VEGFR-3 ）和信号分子VEGF-C 的表达。VEGFR-3形成反馈环路，抑制TLR4-NF-kB 介导的炎症反应，降低细菌感染导致的败血症的发生。
（1）细菌或细菌脂多糖 LPS 在免疫学上相当于 ， TLR4 的本质是 。
（2）过度或持续性的 TLR4 活化引起 ，在 VEGF-C 的刺激下，通过活化 PI3K-Akt1 通路，促进 ，从而抑制 NF-kB 活性，降低败血症的发生。
（3）该细胞能够产生溶菌酶直接杀死病原菌，该过程属于 免疫。吞噬细胞吞噬病菌后会发生死亡现象，该现象属于 。
（4）大多数抗原激发的体液免疫应答，第一种是必须有T 细胞参与才能完成，第二种是有少数抗原物质，可单独刺激B 细胞，为了探究细菌脂多糖LPS 属于哪一类免疫应答，可以选择相同性别的同龄的小鼠进行LPS 接种处理，如下表，实验组对应 组小鼠，如果 ，则该抗原属于第二种。
（5）一般情况下，接受抗原刺激的B 细胞会增殖分化为 ，科学家用LPS分先后两次接种小鼠，并检测相应的抗体的产生量，如图所示：该实验结果说明LPS 能够 。
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内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导入羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoRⅠ、SalⅠ、SphⅠ为限制酶。
请据图回答。
⑴在构建基因表达载体的过程中，应采用______（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是______。
⑵要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的______等调控组件重组起来，构建基因表达载体。
⑶图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是______。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②______技术可培育成转基因克隆山羊。
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内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊 发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导入羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoRⅠ、SalⅠ、SphⅠ为限制酶。
请据图回答。
⑴在构建基因表达载体的过程中，应采用______（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是______。
⑵要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的______等调控组件重组起来，构建基因表达载体。
⑶图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是______。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②______技术可培育成转基因克隆山羊。
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（10分）【生物——现代生物技术专题】
内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导人羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoR I、SaII、SphI为限制酶。
请据图回答。
（1）在构建基因表达载体的过程中，应采用____（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是____。
（2）要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的____筹调控组件重组起来，构建基因表达载体。
（3）图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是____。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②____技术可培育成转基因克隆山羊。
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下图为巨噬细胞炎症反应的新机制研究，巨噬细胞受细菌感染或细菌脂多糖LPS刺激后，升高血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3）和信号分子VEGF-C的表达。最终可以实现抑制TLR4-NF-kB介导的炎症反应，降低细菌感染导致的败血症的发生。结合下图，相关分析错误的是：
A.VEGFR-3的化学本质最可能是糖蛋白，细菌的脂多糖LPS属于抗原
B.抑制TLR4-NF-kB介导的炎症反应是通过抑制NF-kB的表达来实现
C.若该细胞通过产生的溶菌酶直接杀死细菌，则该过程属于特异性免疫
D.抑制TLR4-NF-kB介导的炎症反应存在VEGFR-3和VEGF-C的反馈
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