（10分）【生物——现代生物技术专题】
内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导人羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoR I、SaII、SphI为限制酶。
请据图回答。
（1）在构建基因表达载体的过程中，应采用____（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是____。
（2）要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的____筹调控组件重组起来，构建基因表达载体。
（3）图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是____。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②____技术可培育成转基因克隆山羊。
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（10分）【生物——现代生物技术专题】
内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导人羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoR I、SaII、SphI为限制酶。
请据图回答。
（1）在构建基因表达载体的过程中，应采用____（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是____。
（2）要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的____筹调控组件重组起来，构建基因表达载体。
（3）图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是____。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②____技术可培育成转基因克隆山羊。
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内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导入羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoRⅠ、SalⅠ、SphⅠ为限制酶。
请据图回答。
⑴在构建基因表达载体的过程中，应采用______（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是______。
⑵要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的______等调控组件重组起来，构建基因表达载体。
⑶图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是______。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②______技术可培育成转基因克隆山羊。
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内蒙古白绒山羊的血管内皮生长因子基因（VEGF164），若在皮肤毛囊细胞中特异性表达，可促进毛囊 发育和毛发生长，显著提高羊毛产量。科学家将该基因导入羊胎儿的成纤维细胞核，成功培育出转基因克隆山羊。技术流程如下图，其中EcoRⅠ、SalⅠ、SphⅠ为限制酶。
请据图回答。
⑴在构建基因表达载体的过程中，应采用______（填限制酶名称）对质粒和含绿色荧光基因的DNA片段进行酶切，再经相应处理形成重组质粒。其中绿色荧光基因的作用是______。
⑵要使VEGF164在皮肤毛囊中表达，须将它与羊绒蛋白基因的______等调控组件重组起来，构建基因表达载体。
⑶图中①将基因表达载体导入胎儿成纤维细胞核的方法是______。将导入成功的细胞核注入到去核的卵母细胞构成重组细胞，培养成早期胚胎，经图中②______技术可培育成转基因克隆山羊。
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血管内皮生长因子（VEGF）是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。
研究人员利用pVAX1质粒和VEGF基因构建了PVAX1—VEGF的DNA疫苗，为肿瘤免疫治疗奠定基础。回答下列问题：
（1）首先从人的肺癌细胞株A549中提取mRNA，通过_______法获得VEGF基因。
（2）对获取的VEGF基因进行PCR扩增前，需要根据VEGF基因序列设计两种引物，其原因是_________。为便于VEGF基因与质粒pVAX1连接，引物中要增加适当的__________。扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中______过程的温度设定是扩增成败的关键。
（3）构建的PVAX1—VEGF上应含有特定的______（填“复制原点”或“启动子”或“标记基因”），它能被受体细胞的_______所识别，以便于催化转录过程。
（4）DNA疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是________________。
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肿瘤血管生长是肿瘤生长的关键环节，血管内皮生长因子（VEGF）是一种参与促进肿瘤血管生长的蛋白质，VEGF作为治疗癌症的靶分子受到了很多研究者的关注。
（1）VEGF 的受体存在于血管内皮细胞的_____，可促进血管内皮细胞的_______，形成的细胞最终构成新的血管。
（2）研究者利用噬菌体文库筛选能与VEGF特异性结合的多肽。过程如下。
①将人工合成的编码随机六肽的基因插入噬菌体DNA，形成重组DNA分子，用重组DNA分子转化大肠杆菌，大肠杆菌经培养后裂解，产生噬菌体。这些噬菌体构成一个文库，一个包含所有可能六肽的噬菌体文库至少有____种噬菌体组成，在这些噬菌体中可能有某种六肽能与VEGF特异性结合（图一）。
②将VEGF能够与受体结合的部位固定在微孔容器底部，在微孔中加入随机肽文库，一段时间后用缓冲液洗去不能与VEGF结合的噬菌体，然后用含有_____的缓冲液将结合在微孔底部的噬菌体洗脱下来，这种分子能够与微孔容器底部的分子竞争性结合噬菌体，这说明噬菌体与目标分子的结合是_____（可逆或不可逆）的。
③将洗脱下来的噬菌体转入另一试管，加入_____，经过一段时间振荡培养，产生新一代噬菌体库。
④重复步骤②③多次。
（3）在多轮实验后产生的噬菌体文库比第一代噬菌体文库与VEGF的结合能力更强，文库中噬菌体的种类_____，请分析原因：_____。
（4）欲证明筛选到的多肽X能够起到抑制肿瘤生长的作用，研究者设计了这样的实验：将多肽X溶液注射到⼀只肿瘤模型小鼠体内，（肿瘤型鼠是天然条件下就会产生肿瘤的小鼠品系），检测VEGF与VEGF受体的结合能力。请对该实验做出评价并加以完善___________________________________。测VEGF与VEGF受体的结合能力。请对该实验做出评价并加以完善___________________________________。
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血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的诱导肿瘤血管生成的最强烈的血锌生成因子，针对VEGF生产的抗肿瘤药物，是治疗癌症的一个方向；芝加哥大学的Katherine Knight博士成功地在转基因兔中获得骨髄瘤样肿瘤，经技术改进，能高产量地生产兔单克隆抗体：我国江苏省某公司首次在全球成功开发出人源化兔单抗药物“注射用人源化抗VEGF单克隆抗体”（SIM63）,有效打破了跨国公司的技术垄断。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。请回答下列相关问题：
（1）动物细胞在体外培养的技术属于 工程，由于人们对动物细胞所需的营养物质没有完全搞淸楚，在使用合成培养基时，通常需要加入 等一些天然成分：在培养时除提供细胞所需的O2外，还需要CO2，其作用是 。
（2）在基因工程中，将目的基因导入动物细胞现今极常用、极有效的方法是 ，要在短时间内扩增大量的目的基因采用 技术，这个技术中的关键酶是 。
（3）当VEGF作为抗原进入动物体内时，动物体内的某些B细胞分化为浆细胞，这种浆细胞只分泌针对VEGF的一种抗体，但B细胞在体外培养不会无限增殖，解决这一问题的方法是通过动物细胞融合技术得到杂交瘤细胞，常用的化学诱导融合试剂为 ，要分离出杂交瘤细胞,应该用 培养基进行筛选，单克隆抗体最主要的优点是它的 ,并可大量制备。
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生长因子通常是指具有刺激细胞生长的多肽类物质，主要通过与细胞膜上特异性的受体结合，来调节细胞生长及相关的功能。请根据以下提供的实验材料与用具，来研究内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）对小鼠干细胞分化的影响，完成以下问题。
实验原理：VEGF和PIGF均能促进干细胞生长，干细胞分化后细胞内________会明显增加，可用________来判断干细胞是否分化。
实验材料：怀孕的小鼠，干细胞培养液、VEGF试剂、PIGF试剂、生理盐水、细胞培养瓶、检测试剂盒、CO2培养箱等。
（要求与说明：答题时不考虑加入试剂后的体积变化等误差。）
实验思路：
（1）在 条件下，取出小鼠胚胎的肝脏，用机械法剪碎至1mm3大小的组织块，再用适当的方法获得干细胞悬浮液。
（2）取动物细胞培养瓶，平均分成若干组，并标号，每组设置若干个重复，每个培养瓶 。
（3） 。
（4）在 中培养一段时间后，用试剂盒检测培养液中Akt蛋白含量，统计并分析所得数据。
预测结果：请用柱形图表示支持VEGF试剂和PIGF试剂能共同促进小鼠干细胞分化的实验结果。
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（14分）生长因子通常是指具有刺激细胞生长的多肽类物质，主要通过与细胞膜上特异性的受体结合，来调节细胞生长及相关的功能。请根据以下提供的实验材料与用具，来研究内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）对小鼠干细胞分化的影响，完成以下问题。
实验原理：
VEGF和PIGF均能促进干细胞生长，干细胞分化后细胞内________会明显增加，可用________判断干细胞是否分化。
实验材料：
怀孕的小鼠，干细胞培养液、VEGF试剂、PIGF试剂、生理盐水、细胞培养瓶、检测试剂盒、CO2培养箱等。（要求与说明：答题时不考虑加入试剂后的体积变化等误差。）
实验思路：
（1）在 条件下，取出小鼠胚胎的肝脏，用机械法剪碎至1mm3大小的组织块，再用适当的方法获得干细胞悬浮液。
（2）取动物细胞培养瓶，平均分成若干组，并标号，每组设置若干个重复，每个培养瓶 。
（3） 。
（4）在 中培养一段时间后，用试剂盒检测培养液中Akt蛋白含量，统计并分析所得数据。
预测结果：请用柱形图表示支持VEGF试剂和PIGF试剂能共同促进小鼠干细胞分化的实验结果。
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［生物—选修3现代生物科技专题
人的内皮抑素（一种蛋白质）能诱导血管内皮细胞凋亡，进而抑制新血管的产生。临床上通过静脉注射含有内皮抑素基因的腺病毒感染肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生并释放内皮抑素，抑制新生血管的形成，使肿瘤细胞进人休眠状态并诱导其凋亡。回答下列问题：
（1）从肝细胞中提取总mRNA,利用逆转录酶合成 ，根据内皮抑素基因的 设计并合成引物，利用PCR技术得到大量内皮抑素基因。
（2）在构建含内皮抑素基因的腺病毒并导人受体细胞的过程中，以 作为工具酶，以 作为载体。
（3）在进入临床使用前，需用体外培养的血管内皮细胞进行生理、病理检测。为获得大量的血管内皮细胞，首先用 酶处理血管内皮组织，使其分散成单个细胞，制成细胞悬液，然后将其放人含 等一些天然成分的合成培养基中培养。
（4）血管内皮细胞被重组腺病毒感染后，若通过 方法检测呈阳性并观察到细胞凋亡，则说明内皮抑素基因得到表达且具有生物学活性。
（5）临床上将含内皮抑素基因的腺病毒通过静脉注射感染肿瘤细胞，使肿瘤生长受到抑制，这种治疗方法属于 （填“体内”或“体外”）基因治疗。
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（12分）如图为巨噬细胞炎症反应的新机制研究，巨噬细胞受细菌感染或细菌脂多糖 LPS 刺激后，升高血管内皮生长因子受体3（ VEGFR-3 ）和信号分子VEGF-C 的表达。VEGFR-3形成反馈环路，抑制TLR4-NF-kB介导的炎症反应，降低细菌感染导致的败血症的发生。
（1）细菌或细菌脂多糖 LPS在免疫学上相当于 ， TLR4的本质是 。
（2）过度或持续性的 TLR4 活化引起 ，在 VEGF-C 的刺激下，通过活化 PI3K-Akt1 通路，促进 ，从而抑制 NF-kB 活性，降低败血症的发生。
（3）该细胞能够产生溶菌酶直接杀死病原菌，该过程属于 免疫。吞噬细胞吞噬病菌后会发生死亡现象，该现象属于 。
（4）大多数抗原激发的体液免疫应答，第一种是必须有T细胞参与才能完成，第二种是有少数抗原物质，可单独刺激B细胞，为了探究细菌脂多糖LPS属于哪一类免疫应答，可以选择相同性别的同龄的小鼠进行LPS接种处理，如下表，实验组对应 组小鼠，如果 ，则该抗原属于第二种。
| 处理胸腺 | 是否产生相应浆细胞 | 是否产生相应的抗体 | |
| 甲组小鼠 | 切除 | ||
| 乙组小鼠 | 不切除 |
（5）一般情况下，接受抗原刺激的B细胞会增殖分化为 ，科学家用LPS分先后两次接种小鼠，并检测相应的抗体的产生量，如图所示：该实验结果说明LPS能够 。
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