经研究表明，在多种肿瘤细胞中的TOP2A蛋白大量表达，因此成为抗肿瘤的研究靶点，某科研单位...

经研究表明，在多种肿瘤细胞中的TOP2A蛋白大量表达，因此成为抗肿瘤的研究靶点，某科研单位制作了TOP2A蛋白的单克隆抗体。请回答：

(1)利用基因工程制备TOP2A蛋白：将TOP2A蛋白基因和质粒用___________处理并连接成重组质粒，然后导入经_________处理的大肠杆菌，并将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，经离心得到菌体，破碎提纯得到TOP2A蛋白。

(2)TOP2A蛋白单克隆抗体的制备:将TOP2A蛋白反复多次注射到小鼠体内，使其发生_________，取经过免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞在物质_________介导下发生细胞融合，形成杂交瘤细胞。并将各杂交瘤细胞单独分装培养，经筛选、___________后，获得能产生单一抗体的__________

A.连续细胞系B.有限细胞系C.连续细胞株D.有限细胞株

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（10分）研究表明，HER2/neu是一种原癌基因，它表达的H蛋白在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长，目前已成为有效的生物治疗手段。

（1）选择H蛋白作为单克隆抗体的作用靶点，是因为H蛋白在成年个体的正常组织中___________（填“低表达”或“高表达”）。H蛋白是一个跨膜蛋白，结构如图12所示。制备免疫小鼠用的H蛋白（抗原）时，应构建___________区基因，转入原核细胞表达并提纯。

（2）将H蛋白注射到小鼠体内，取该小鼠的脾脏细胞与___________细胞进行融合，使用的化学诱导剂是______________，细胞融合的原理是_________________。

（3）将融合细胞在__________培养基中培养，一段时间后培养基中只有杂交瘤细胞生长。将杂交瘤细胞转到多孔培养板上培养，应用____________技术进行抗体阳性检测。经多次筛选，就能得到产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。

（4）将筛选得到的杂交瘤细胞，经过_______________或小鼠腹腔内培养，获取大量的单克隆抗体。

（5）治疗乳腺癌时，可单独使用抗H蛋白单克隆抗体，也可将该单克隆抗体与抗癌药物结合构建“生物导弹”，杀死癌细胞。这充分体现了单克隆抗体______________的特点。

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研究表明，HER2/neu是一种原癌基因，它表达的H蛋白在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长，目前已成为有效的生物治疗手段。

(1)H蛋白在成年个体的正常组织中表达量____(填“低”或“高”)。H蛋白是一个跨膜蛋白，结构如图所示。制备免疫小鼠用的H蛋白(抗原)时，应构建_______区基因，转入受体细胞表达并提纯。

(2)为扩增出大量目的基因需用到PCR技术。常规PCR技术一般包括变性、退火、延伸等步骤，退火(55~60℃)时_________________碱基互补配对。设计引物是PCR技术的关键之一，某同学设计的两组引物如下表所示，其中引物对______(填“A”或“B”)设计不合理。

(3)制备抗H蛋白单克隆抗体时，需将H蛋白注射到小鼠体内，这样做的目的是使小鼠体内产生_________。

(4)治疗乳腺癌时，可单独使用抗H蛋白单克隆抗体，也可以将______结合制成“生物导弹”，杀死癌细胞。

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研究表明，HER2/neu是一种原癌基因，它表达的H蛋白在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长，目前已成为有效的生物治疗手段。

（1）原癌基因的作用是____________________。

（2）H蛋白是一个跨膜蛋白，结构如图所示。制备免疫小鼠用的H蛋白（抗原）时，应构建胞外区基因，转入原核细胞表达并提纯。选择胞外区的原因是_________________。为了扩增出大量胞外区需要用到PCR技术。常规PCR技术一般包括变性、退火、延伸等步骤，退火的目的是________________________。设计引物是PCR技术的关键步骤之一，某同学设计的两组引物如下表所示。_________（填“引物对A”或“引物对B”）设计不合理，并说出不合理的理由：______________________________________。

（3）制备抗H蛋白单克隆抗体时，需将H蛋白注射到小鼠体内。这样做的目的是_____________________________。制备抗H蛋白单克隆抗体时，需要用到细胞融合技术，该技术的主要优点是_____________________________________。

（4）治疗乳腺癌时，方法之一是单独使用抗H蛋白单克隆抗体，试写出治疗乳腺癌的另一种疗效高、毒副作用小的、不损伤正常细胞的方法：________________。

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研究表明，HER2/neu是一种原癌基因，它表达的H蛋白在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长，目前已成为有效的生物治疗手段。

（1）选择H蛋白作为单克隆抗体的作用靶点，是因为H蛋白在成年个体的正常组织中_________（填“低表达”或“高表达”）。H蛋白是一个跨膜蛋白，结构如图所示。制备免疫小鼠用的H蛋白（抗原）时，应构建_________区基因，转入原核细胞表达并提纯。

（2）将H蛋白注射到小鼠体内，取该小鼠的脾脏细胞与_________细胞进行融合，使用的化学诱导剂是_________，细胞融合的原理是_________。

（3）将融合细胞在_________培养基中培养，一段时间后培养基中只有杂交瘤细胞生长。将杂交瘤细胞转到多孔培养板上培养，应用_________技术进行抗体阳性检测。经多次筛选，就能得到产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。

（4）将筛选得到的杂交瘤细胞，经过_________或小鼠腹腔内培养，获取大量的单克隆抗体。

（5）治疗乳腺癌时，可单独使用抗H蛋白单克隆抗体，也可将该单克隆抗体与抗癌药物 结合构建“生物导弹”，杀死癌细胞。这充分体现了单克隆抗体_________的特点。

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端粒酶是一种由催化蛋白和RNA模板组成的酶，可合成染色体末端的DNA。研究表明端粒酶对肿瘤细胞的永生化是必须的，因此端粒酶可作为抗肿瘤药物的良好靶点。下列相关叙述，错误的是

A. 端粒酶是一种逆转录酶，能延长端粒

B. 抑制癌细胞中端粒酶活性可控制癌细胞的增殖

C. 显微观察肿瘤切片，所有肿瘤细胞的染色体数目相同

D. 目前有手术切除、放疗和化疗等手段治疗癌症

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研究表明，青蒿素对多种癌细胞均有抑制作用。转铁蛋白是人体内重要的转运蛋白，由于恶性肿瘤细胞表面过度表达转铁蛋白受体，因此转铁蛋白被广泛应用为药物载体，将抗肿瘤药物转运到肿瘤细胞，实现靶向药物运输。在抗癌作用机制的研究中发现，肿瘤细胞的细胞膜是青蒿素攻击的主要靶点。肿瘤细胞膜遭到破坏后，其通透性就随之发生改变,一方面细胞外大量的钙离子会进入细胞内，诱导细胞程序化死亡,即“凋亡”。另一方面细胞膜通透性的增加导致细胞内的渗透压发生变化,细胞吸收大量水分后,发生膨胀直至细胞死亡，即“胀亡”。

(1)肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体的化学本质是__________,细胞癌变是细胞_________分化的结果。

(2)设计实验验证青蒿素对癌细胞有抑制作用。（注意:转铁蛋白单独对癌细胞不起作用，青蒿素单独对癌细胞也不起作用，药物对正常细胞不起作用。）

材料用具:乳腺癌细胞悬液、正常乳腺细胞悬液、转铁蛋白、水溶性青蒿素、血细胞计数板、显微镜等。

①_______________________________。

②______________________________。

③_______________________________。

④_______________________________。

(3)预测实验结果_______________________________。

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PD-1与PD-L1是目前肿瘤治疗的热门靶点蛋白。sPD-1是PD-1的可溶形式，能够被分泌至胞外。为探讨sPD-1对肿瘤疫苗抗乳腺癌作用的影响，科研人员进行了相关研究。

（1）因为癌细胞具有____________等特征，癌症的治疗非常困难。肿瘤疫苗是新型治疗方法，其原理是将肿瘤抗原导入人体内，激活患者自身的免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的，下列可做为肿瘤抗原的是____________（填写序号）。

①衰老肿瘤细胞②肿瘤相关蛋白或多肽③含有肿瘤抗原基因的表达载体④肿瘤细胞内的脱氧核糖

（2）研究发现，肿瘤疫苗可激活T细胞并诱导其产生IFN-γ（一种淋巴因子）。用不同浓度的IFN-γ培养小鼠乳腺癌细胞，并对其细胞膜上PD-L1表达情况进行检测，结果如图1：

与对照组相比，实验组小鼠乳腺癌细胞膜蛋白PD-L1表达____________。

（3）进一步研究发现，在正常机体中，组织细胞表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合（如图2），使T细胞活性被适当抑制，避免了免疫过强而导致自身免疫性疾病的发生。肿瘤细胞PD-L1的高水平表达会____________（填“降低”或“增加”）肿瘤细胞被免疫系统清除的可能性。研究发现使用肿瘤疫苗时随着时间的延长而作用效果减弱，根据（2）和（3）推测可能的原因是____________，从而抑制了T细胞对肿瘤细胞的清除作用。

（4）为了解决这一问题，科研人员对作为肿瘤疫苗的衰老癌细胞疫苗进行了基因改造，使其可以大量分泌可与PD-L1结合的sPD-1，并进行了如下实验：实验小鼠皮下接种小鼠乳腺癌细胞，随机分为三组，分别给予衰老癌细胞疫苗、高表达sPD-1的衰老癌细胞疫苗、磷酸缓冲液（对照）处理，分别于6、12、18、24、30天记录并统计无瘤小鼠的比例，结果如图3所示。综合上述实验分析，解释高表达sPD-1的衰老癌细胞疫苗组无瘤小鼠比例最高的可能机理____________。

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PD-1与PD-L1是目前肿瘤治疗的热门靶点蛋白。sPD-1是PD-1的可溶形式，能够被分泌至胞外。为探讨sPD-1对肿瘤疫苗抗乳腺癌作用的影响，科研人员进行了相关研究。

（1）因为癌细胞具有____________等特征，癌症的治疗非常困难。肿瘤疫苗是新型治疗方法，其原理是将肿瘤抗原导入人体内，激活患者自身的免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的，下列可做为肿瘤抗原的是____________（填写序号）。

①衰老肿瘤细胞②肿瘤相关蛋白或多肽③含有肿瘤抗原基因的表达载体④肿瘤细胞内的脱氧核糖

（2）研究发现，肿瘤疫苗可激活T细胞并诱导其产生IFN-γ（一种淋巴因子）。用不同浓度的IFN-γ培养小鼠乳腺癌细胞，并对其细胞膜上PD-L1表达情况进行检测，结果如图1：

与对照组相比，实验组小鼠乳腺癌细胞膜蛋白PD-L1表达____________。

（3）进一步研究发现，在正常机体中，组织细胞表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合（如图2），使T细胞活性被适当抑制，避免了免疫过强而导致自身免疫性疾病的发生。肿瘤细胞PD-L1的高水平表达会____________（填“降低”或“增加”）肿瘤细胞被免疫系统清除的可能性。研究发现使用肿瘤疫苗时随着时间的延长而作用效果减弱，根据（2）和（3）推测可能的原因是____________，从而抑制了T细胞对肿瘤细胞的清除作用。

（4）为了解决这一问题，科研人员对作为肿瘤疫苗的衰老癌细胞疫苗进行了基因改造，使其可以大量分泌可与PD-L1结合的sPD-1，并进行了如下实验：实验小鼠皮下接种小鼠乳腺癌细胞，随机分为三组，分别给予衰老癌细胞疫苗、高表达sPD-1的衰老癌细胞疫苗、磷酸缓冲液（对照）处理，分别于6、12、18、24、30天记录并统计无瘤小鼠的比例，结果如图3所示。综合上述实验分析，解释高表达sPD-1的衰老癌细胞疫苗组无瘤小鼠比例最高的可能机理____________。

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神经纤毛蛋白-1 (NRP-1) 是一种多功能糖蛋白，在多种肿瘤组织中呈高表达，可与血管内皮生长因子结合促进肿瘤血管的形成，使肿瘤体积增大。科研人员通过制备NRP-1单克隆抗体，开展对小鼠的乳腺癌肿块进行靶向治疗的研究。请分析回答：

（1）制备单克隆抗体涉及的动物细胞工程常用技术手段有_________________________(写出两项)。

（2）制备时，首先给小鼠注射___________________________，分离得到B细胞。将B细胞与骨髓瘤细胞诱导融合后得到杂交瘤细胞，经系列处理选出______________________细胞注射到小鼠腹腔中，从腹水中提取到大量的NRP-1单克隆抗体。

（3）为了论证制取的单克隆抗体的治疗效果，研究者选择生长状况一致的小鼠，分别注射等量的乳腺癌细胞悬液，经饲养后，各小鼠均形成了体积基本相同的肿瘤。

①将上述小鼠随机分成实验组和对照组，实验组和对照组应分别注射____________，___________________，且每隔3天重复进行相同的注射操作，一段时间后测算发现，实验组小鼠的肿瘤体积都小于对照组，原因可能是_________________________发生特异性结合，阻断了___________________________的结合，从而抑制了肿瘤内血管生成，导致肿瘤体积减小。

②上述实验小鼠应选用没有___________________(器官)的动物模型鼠，由于这种鼠存在免疫缺陷，实验时可以避免小鼠的免疫系统对NRP-1单克隆抗体和乳腺癌肿块进行攻击，从而保证实验结果更可靠。

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