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为了研究视神经病变诱导基因（OPTN）的分子机制，科研人员用OPTN基因的部分DNA片段构建表达载体，导入细胞后转录出的RNA会抑制细胞中OPTN蛋白的合成。实验中使用的DNA片段和载体上限制酶的识别序列如下：
| 限制酶 | BglⅡ | BamHⅠ | HindⅢ | XhoⅠ |
| 识别序列和切割位点 | A↓GATCT TCTAG↑A | G↓GATCC CCTAG↑G | A↓AGCTT TTCGA↑A | G↓TCGAG GAGCT↑C |
请回答：
（1）应选用BamHⅠ和HindⅢ切割载体质粒，理由是____________。
（2）重组质粒上____________（填“有”或“无”）BamHⅠ的识别序列，因此可通过酶切法鉴定质粒是否重组成功，方法如下：用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制酶处理质粒，未重组的质粒将产生____________种片段，重组的质粒将产生____________种片段。
（3）重组质粒导入细胞后，能抑制细胞中OPTN蛋白合成的原因是____________。
（4）要证明导入重组质粒的细胞中OPTN基因的表达受到抑制，需要设置____________作为对照组。通常采用____________法检测细胞中OPTN蛋白的表达水平。
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研究发现，斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，为了研究该基因转录起始位点上游的部分序列对该基因表达的影响，科研人员做了如下实验。
（1）为确定HuC基因的转录起始位点，提取斑马鱼早期胚胎神经细胞的总RNA，以与____________互补的一段单链DNA序列作为引物，加入____________酶，获得cDNA。对该cDNA的序列进行测定，与HuC基因的序列比对，确定转录起始位点，定为+1号碱基，其上游的碱基定为负值。
（2）为了探究转录起始位点上游不同长度片段在基因转录中的作用，科研人员从____________（选填“基因组”或“cDNA”）文库中获取该转录起始位点上游的片段，用____________酶处理此片段和含GFP（绿色荧光蛋白）基因的载体，获得重组DNA分子。
（3）用不同种类的限制酶重复步骤（2），获得不同长度的重组DNA分子，通过显微注射方法分别导入斑马鱼的____________细胞，通过荧光显微镜观察早期胚胎神经细胞、肌肉细胞中的荧光强度，结果如图所示。
①获得图中所示的重组DNA分子，需要用到的限制酶有____________种。
②据图分析，缺失HuC基因上游的____________片段就会造成HuC基因在所有细胞中表达被完全抑制。-1962bp至-432bp片段的存在会____________HuC基因在肌肉细胞中的表达，对神经细胞中的表达____________。
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研究发现，斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，为了研究该基因转录起始位点上游的部分序列对该基因表达的影响，科研人员做了如下实验。
（1）为确定HuC基因的转录起始位点，提取斑马鱼早期胚胎神经细胞的总RNA，以与__________互补的一段单链DNA序列做为引物，加入________酶，获得cDNA。对该cDNA的序列进行测定，与HuC基因的序列进行比对，确定转录起始位点，定为+1号碱基，其上游的碱基定为负值。
（2）为了探究转录起始位点上游不同长度片段在基因转录中的作用，科研人员从__________（选填“基因组”或“cDNA”）文库中获取该转录起始位点上游的片段，用__________酶处理此片段和含GFP （绿色荧光蛋白）基因的载体，获得重组DNA分子。
（3）用不同种类的限制酶重复步骤（2），获得不同长度的重组DNA分子，通过显微注射方法分别导入斑马鱼的__________细胞，通过荧光显微镜观察早期胚胎神经细胞、肌肉细胞中的荧光强度，结果如图所示。
注：“+”多少表示荧光强度，“-”表示未检测到荧光。虚线表示直接连接在一起。
①获得图中所示的重组DNA分子，需要用到的限制酶有__________种。
②据图分析，缺失HuC基因上游的__________片段就会造成HuC基因在所有细胞中表达被完全抑制。-1962bp至-432bp片段的存在会__________HuC基因在肌肉细胞中的表达，对神经细胞中的表达__________。
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GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）完成图中A过程必需的工具是 ；该基因治疗的受体细胞为 。
（2）基因工程最核心的步骤是 。
（3）若要构建含GDNF基因的表达载体，则需选择图中的 限制酶进行酶切。
（4）限制酶XhoI和限制酶HpaI的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如下图表示四种质粒,其中,箭头所指部位为酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示GDNF基因运载体的是 。
（5）下列有关限制性核酸内切酶和质粒运载体的描述，正确的是_______。
A．限制性核酸内切酶能识别DNA、切割DNA任一序列
B．限制性核酸内切酶的作用部位与RNA聚合酶的相同
C．使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解
D．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的
（6）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为 个，反向连接的重组载体产生片段有 （多选）。
①100bp ②200bp ③600bp ④700bp ⑤6000bp ⑥6500bp
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GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）完成图中A过程必需的工具是 ；该基因治疗的受体细胞为 。
（2）若要构建含GDNF基因的表达载体，则需选择图中的 限制酶进行酶切。
（3）限制酶XhoI和限制酶HpaI的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如下图表示四种质粒,其中,箭头所指部位为酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示GDNF基因运载体的是 。
（4）下列有关限制性核酸内切酶和质粒运载体的描述，错误的是_______（多选）。
A．限制性核酸内切酶能识别DNA、切割DNA任一序列
B．限制性核酸内切酶的作用部位与RNA聚合酶的相同
C．使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解
D．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的
（5）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为 个，反向连接的重组载体产生片段有 （多选）。
①100bp ②200bp ③600bp ④700bp ⑤6000bp ⑥6500bp
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GDNF是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究．请回答：
（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 ．
（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切．
（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）．为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示．图中第 泳道显示所鉴定的载体是正向连接的．
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的 与提取的蛋白质杂交．当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验．
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【生物-现代生物科技专题】（10分）
GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 。
（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切。
（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第
泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的
与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
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GDNF是一种神经营养因子，研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），经筛选得到的载体主要有三种。为鉴定这3种连接方式，选择限制性核酸内切酶对筛选的载体进行酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。若图2中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的，则鉴定时所选的限制性核酸内切酶是（ ）
A.XhoI B.HpaI和BamHI C.HpaI和XhoI D.BamHI和XhoI
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GDNF是一种神经营养因子，研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），经筛选得到的载体主要有三种。为鉴定这3种连接方式，选择限制性核酸内切酶对筛选的载体进行酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。若图2中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的，则鉴定时所选的限制性核酸内切酶是（ ）
A.XhoI B.HpaI和BamHI C.HpaI和XhoI D.BamHI和XhoI
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鸡干抗素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①-④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_____________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了______________和_____________序列，以便于后续的剪切和连接。
(2)步骤②所构建的基因表达载体中末标注出的必需元件还有_______________________，步骤③中需先用__________________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。
(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再通过PCR扩增制备探针，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是_________________________。
(4)用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数(植物受病毒侵染的严重程度)为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79，说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有_______________________________。
